崔晓东 王伊玲 李红霞 李小勇 苏鹏飞 潘瑞朋 刘琼光 胡蓉花

摘  要：了解不同噬菌体在不同环境中的存活情况，探索化学杀菌剂与噬菌体联合防治烟草青枯病的可行性。将P7-1、P1556-1及P1556-2等3种噬菌体与7种化学杀菌剂混合后，置于4 ℃和30 ℃培养箱，测定噬菌体效价随时间的变化规律。结果表明，3个噬菌体在7种杀菌剂中存活时间存在明显差异：3种噬菌体与氢氧化铜和王铜混合后1个月，其效价均为0;对其他5种杀菌剂的耐药由强到弱为P1556-2>P1556-1>P7-1，其中P1556-2在噻唑锌、中生菌素、春雷霉素、喹啉铜和辛菌胺醋酸盐中12个月测定的效价对数值分别为8.73、7.65、7.93、7.39和8.18。部分噬菌体在30 ℃可存活1～5个月，但在4 ℃下可存活6～12个月。噬菌体P1556-2和P1556-1在无致病力青枯菌Trp574中保存，其效价明显高于在无菌水中保存。可见，噬菌体在杀菌剂中的存活（效价）受时间、温度、药剂种类和噬菌体自身特性的影响，氢氧化铜与王铜制剂对噬菌体具有明显抑制作用，4 ℃（低温）下能够延长噬菌体的存活时间。无致病力青枯菌Trp574可用于噬菌体P1556-1和P1556-2的保存和大量培养。

关键词：烟草青枯病;杀菌剂;噬菌体;无致病力青枯菌;存活;效价

Abstract： The survival of bacteriophages of Ralstonia solanacearum in different environments and the feasibility of combined use of chemical agents and phages in disease control were studied. Three phages P7-1， P1556-1 and P1556-2 were mixed with seven kinds of bactericides and stored at 4 ℃ and 30 ℃ respectively， to determine the change of phage titer with time. The results showed that the survival time of the three phages were significantly different in the seven bactericides. The titers of the three phages were zero after mixing with copper hydroxide and copper oxychloride for one month. The resistance to bactericides of the three phages in the order from strong to weak is as follows， P1556-2 > P1556-1> P7-1， and the titer logarithms of P1556-2 were 8.73， 7.65， 7.93， 7.39 and 8.18 in thiazole zinc， zhongshengmycin， chunramycin， oxine-copper and octylamine acetate at 12 months， respectively. Some phages survived from 1-5 months at 30 ℃， but stayed alive for 6-12 months at 4 ℃. P1556-2 and P1556-1 had higher titers when they were stored in avirulent strain of R. solanacearum Trp574 than in sterile water. So， the titers were affected by time， temperature， bactericides and phages. Copper hydroxide and copper oxychloride showed obvious inhibition on phages. The survival time of phages can be prolonged at 4 ℃ （low temperature）. The avirulent strain of R. solanacearum Trp574 can be used for preservation and culture of P1556-1 and P1556-2.

Keywords： tobacco bacterial wilt; bactericide; bacteriophage; avirulent strain of Ralstonia solanacearum; activity; titer.

茄科勞尔氏菌（Ralstonia solanacearum）（俗称青枯菌），是引起植物青枯病的病原细菌，寄主范围广泛，能侵染54个科450多种植物[1-2]。烟草青枯病是我国烟草种植区普遍发生且危害严重的病害，其防治一直是生产上的难题。化学防治具有方便快速等优点，如20%噻唑锌悬浮剂、3%中生菌素可湿性粉剂等对青枯病有一定的防治效果[3-5]。但长期大量使用化学农药易导致环境污染和病菌抗药性等问题，由此，青枯病生物防治受到国内外重视[6-8]，其中包括青枯菌无致病力菌株的应用[9，13]，以及利用噬菌体防治作物青枯病[10-12]。1990年，日本报道利用青枯菌噬菌体防治烟草青枯病，效果较好[13]，从烟田中分离烟草青枯菌噬菌体，具有巨大应用潜力[14]。由于青枯菌的遗传多样性及噬菌体的高度特异性，导致噬菌体的防治效果和使用范围受到限制[15]。化学杀菌剂和生防菌联用防控真菌病害，显示出良好应用前景[16]。噻菌铜和生防芽胞菌AR03联合使用明显提高烟草青枯病的防治效果，大幅降低了化学药剂的使用量[17]，但化学杀菌剂与噬菌体联合使用防治烟草青枯病研究，迄今尚未见报道。噬菌体与化学杀菌剂联合使用，需要明确杀菌剂对噬菌体存活的影响，尤其要明确噬菌体的保存时间。此外，利用噬菌体防治植物细菌性病害，关键技术是噬菌体的扩大繁殖，在培养噬菌体过程中，存在致病宿主菌的风险。基于此，本研究拟测定3种青枯菌噬菌体在7种细菌杀菌剂和无致病力青枯菌中的存活情况，为化学杀菌剂与噬菌体联合使用防治烟草青枯病提供参考。

1  材料与方法

1.1  供试药剂

选择目前我国防治农作物细菌病害常用的7种细菌杀菌剂（表1），均为市售。

1.2  供试菌株与噬菌体

宿主青枯菌菌株Tb1546分离自江西赣州烟草患青枯病植株，中等致病力;青枯菌无致病力菌株Trp574分离自江西烟草植株，通过遗传改造后丧失了对烟草的致病力[18]。供试噬菌体P7-1，P1556-1，P1556-2，分离自江西省和广东省烟田，属于有尾噬菌体目中的不同噬菌体科。以上供试菌株与噬菌体均由华南农业大学植物保护学院细菌研究室分离、保存和提供。

1.3  培养基

固体培养基：牛肉浸膏3 g，酵母浸膏3 g，蛋白胨3 g，硫酸镁0.25 g，磷酸二氢钾0.5 g，磷酸氢二钾2 g，蔗糖15 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 L。

半固体培养基：牛肉浸膏3 g，酵母浸膏3 g，蛋白胨3 g，硫酸镁0.25 g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾2 g，蔗糖15 g，琼脂粉8 g，蒸馏水1 L。

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1 L。

TTC培养基：水解干酪素1 g，蛋白胨10 g，甘油5 mL，琼脂32 g，1%三苯基四氮唑（TTC）10 mL，蒸馏水1 L。

1.4  青枯菌及噬菌体的培养

用TTC平板活化Tb1546和Trp574，单菌落接种于LB培养液中，30 ℃、200 r/min培养24 h，获得细菌悬浮液。

以Tb1546为宿主菌，用双层平板法[18]分别孵化P7-1，P1556-1和P1556-2，戳取噬菌斑，与Tb1546菌液及LB混合，30 ℃、200 r/min振荡培养24 h，获得噬菌体液。

1.5  不同杀菌剂对噬菌体存活的影响

将噬菌体P7-1（5.07×108 PFU/mL）、P1556-1（1.45×107 PFU/mL）、P1556-2（3.36×108 PFU/mL）分别与7种杀菌剂混合，使各药剂最终稀释倍数为600倍，噬菌体和无菌水混合作为CK对照。将上述各处理在4 ℃冰箱和30 ℃培养箱中保存，其中4 ℃代表低温环境，30 ℃代表亚高温或常温环境，每处理重复3次。每隔1个月取样，参照余成鹏[19]方法，测定噬菌体效价（PFU/mL），连续测定12个月。噬菌体效价（PFU/mL）为每毫升噬菌体液在平板上所形成的噬菌斑个数。

1.6  噬菌体在无致病力青枯菌中的存活

将噬菌体液、Trp574菌悬液和无菌水按1：1：8的比例混合，置于30 ℃培养箱保存，噬菌体液和无菌水按1∶9混合为CK对照，每处理3个重复。按1.5方法，每月测定1次效价，连续测定12月。

1.7  数据处理与统计分析

使用Excel 2010进行数据处理，对获得的效价进行对数替换Log（PFU/mL+1），使用IBM SPSS statistic 21对各数据进行DMRT（Duncan’s multiple range test，邓肯氏复极差检验）法的单因素方差分析，比较显著差异水平（α=0.05）。

2  结  果

2.1  不同杀菌剂对噬菌体存活的影响

2.1.1  杀菌剂对噬菌体P7-1存活的影响  结果显示（表2），4 ℃下，在第12個月检测，CK、中生菌素、春雷霉素和喹啉铜等处理中噬菌体仍然有存活，但效价降低了1个数量级;噻唑锌处理效价降低了4个数量级;辛菌胺醋酸盐、氢氧化铜和王铜处理，噬菌体在前期效价为0。而在30 ℃条件下，除噻唑锌外，其他杀菌剂处理在6个月时均检测不到噬菌体。可见，杀菌剂对P7-1的存活具有影响，

P7-1在氢氧化铜、王铜和辛菌胺醋酸盐中的存活时间大大缩短，且在30 ℃条件下比在4 ℃下存活时间更短。

2.1.2  杀菌剂对噬菌体P1556-1存活的影响  表3显示，在4 ℃条件下，CK、噻唑锌、中生菌素、春雷霉素和喹啉铜等处理中，P1556-1在12个月后仍有存活，但各处理效价均比CK明显降低（p<0.05）;而辛菌胺醋酸盐、氢氧化铜和王铜等处理，在第1个月测定，P1556-1效价为0，表明，这3种杀菌剂对P1556-1具有明显的抑制作用（p<0.05）。在30 ℃存放条件下，只有喹啉铜处理的P1556-1在12个月仍有存活，但效价比CK降低了5个数量级，噻唑锌和春雷霉素处理，在1～2个月内噬菌体无存活。

2.1.3  杀菌剂对噬菌体P1556-2存活的影响  表4显示，除了氢氧化铜和王铜处理外，其他处理，在第12个月检测，P1556-2仍有存活，其效价与CK相比，差异不显著（p>0.05），表明，噻唑锌、中生菌素、春雷霉素、喹啉铜和辛菌胺醋酸盐等杀菌剂对P1556-2影响较小，P1556-2在这些杀菌剂中可以存活1年。

2.2  噬菌体在无致病力青枯菌Trp574中的存活

P7-1、P1556-1、P1556-2与Trp574混合后在30 ℃存放，结果显示（图1），第3个月测定P7-1效价为0，说明P7-1不易在Trp574中存活，而P1556-1和P1556-2在第12个月测定其效价明显高于CK（图1），说明在30 ℃下，P1556-1和P1556-2能够利用Trp574进行繁殖，延长噬菌体的保存时间。

3  讨  论

目前，生产上对烟草青枯病的防治，仍然广泛使用化学杀菌剂[20]，药剂的减量增效以及化学农药与生物制剂的结合是防治作物青枯病新的发展方向。本研究测定了3个青枯菌噬菌体在7种细菌杀菌剂和无致病力青枯菌中的存活情况，其结果可为噬菌体协同化学杀菌剂防治烟草青枯病奠定基础。

我們前期研究表明，烟草青枯菌噬菌体P7-1、P1556-1及P1556-2具有裂解多个青枯菌菌株的特性，显示其良好的应用前景[19]，但不清楚它们能与哪些化学杀菌剂混用。本结果显示这3个噬菌体在不同杀菌剂中存活时间存在明显差异，其中P1556-2耐（抗）药性最强，可以在噻唑锌、中生菌素、辛菌胺醋酸盐、春雷霉素、喹啉铜中存活12个月，但3个噬菌体在氢氧化铜和王铜中的存活时间较短，这与84%王铜对噬菌体有一定灭活作用的研究结果基本相符[21]。化学制剂、pH和杀菌物质对噬菌体活性产生不利的影响[14，22]，本文结果也发现，不同噬菌体对不同杀菌剂的敏感性不同，3个噬菌体对杀菌剂敏感性由弱至强表现为P1556-2>P1556-1> P7-1，因此生产上杀菌剂与噬菌体的混用需要谨慎。研究表明，20%噻唑锌、3%中生菌素以及1.8%辛菌胺醋酸盐对青枯病等作物细菌性病害有较好防治效果[3-5，23]，结合本文结果认为，生产上可尝试将噻唑锌、中生菌素、辛菌胺醋酸盐、春雷霉素、喹啉铜等药剂与噬菌体P1556-2混合使用，噻唑锌与P7-1混用，喹啉铜与P1556-1混用，以扩大青枯病防治药剂的选择范围和提高防治效果。而氢氧化铜与王铜制剂对噬菌体有明显的抑制作用，不适宜与噬菌体混合使用。最近报道认为，短小芽孢杆菌与化学杀细菌剂具有协同防治烟草青枯病的作用[17]，但噬菌体联合化学杀细菌剂防治烟草青枯病研究，迄今尚未见报道，本研究的结果是初步的，其实际应用还有待于进一步的田间试验。

噬菌体是专性寄生菌，不能离开其宿主菌而长期独立生存，噬菌体的保存是一项极其重要工作。本研究除了探究噬菌体在化学杀菌剂中保存的时间，还比较了噬菌体在4 ℃低温和30 ℃亚高温环境条件下的存活情况，结果表明，噬菌体在4 ℃低温下数量更多，存活的时间更长，支持前人研究结果[24]。这是由于噬菌体是一种寄生于活体细胞内的非细胞生物，低温可降低其新陈代谢，保持活性，因此，低温可提高噬菌体的保存效果，而在室温和亚高温下，由于噬菌体的代谢活动正常，需要消耗宿主菌，在有限的宿主菌情况下，噬菌体将逐渐死亡，导致其数量下降。

利用噬菌体防治植物细菌性病害，需要一定数量的噬菌体。生产出来的噬菌体制剂，在流通、存放和使用过程中保持较高效价，是噬菌体实际应用要解决的问题。通常，噬菌体在没有宿主菌条件下保存，随着时间的延长，其数量逐渐下降[25-26]，但在有宿主菌的条件下，噬菌体保存的时间更长[24]，本研究支持前人研究结果。P1556-1和P1556-2在青枯菌Trp574中不同时间的存活数量，均明显高于各自没有青枯菌的对照，但噬菌体P7-1结果则相反，原因是青枯菌噬菌体具有一定的寄主范围，P7-1寄主范围没有P1556-1和P1556-2广泛[19]，它可能对青枯菌Trp574的侵染能力弱，不适合在Trp574中繁殖，其机理有待于进一步证实。此外，在培养噬菌体过程中，常出现抗噬菌体的宿主菌[18]，因而在用噬菌体防治植物病害时，应去除未被裂解的宿主病原菌，以免造成对防治对象的侵染。但是，去除未被裂解的宿主菌通常较困难[9]，探索噬菌体在无致病力青枯菌中的存活，具有实际意义。林志坚等[9]通过连续超过20代的培养，获得青枯菌无致病力菌株，作为噬菌体扩大繁殖的宿主。我们在前期通过遗传改造获得无致病力青枯菌Trp574[18]，本结果发现，Trp574可作为噬菌体P1556-1和P1556-2保存和大量繁殖的理想宿主菌，可避免噬菌体在田间应用的风险。

4  结  论

试验结果表明，噬菌体在杀菌剂中的存活受时间、温度、药剂种类和噬菌体自身特性的影响，3个噬菌体对化学药剂的耐受性由强至弱为P1556-2> P1556-1>P7-1。P1556-2在噻唑锌、中生菌素、辛菌胺醋酸盐、春雷霉素和喹啉铜等杀菌剂中可存活12个月，氢氧化铜与王铜制剂对噬菌体具有明显抑制作用。噬菌体在4 ℃（低温）下比在30 ℃（亚高温）条件下存活的时间更长。无致病力青枯菌Trp574可用于P1556-1和P1556-2的保存和大量的培养。

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