乔晶晶，张 燕，刘 霞，董建彬， 张伟靖*

（1.榆林市第一医院 神经内科，陕西 榆林 719000；2.榆林市第一医院 骨科，陕西 榆林 719000)

健脑安神片收载于2020 版《中国药典》（一部），由酒黄精、淫羊藿、枸杞子、鹿茸、南五味子、制远志、熟地黄等十六味中药组成，具有滋补强壮、镇静安神等作用，用于治疗神经衰弱、头痛、头晕等症[1]。方中淫羊藿中主要含有朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、宝藿苷I 等成分，其有免疫调节、保护神经系统等作用[2-3]，本院应用及临床报道疗效较好[4-6]。尽管临床应用较为满意，但该产品的基础研究报道较少，有健脑安神片质量标准及其中淫羊藿苷定量的的研究[7-9]，未发现关于采用HPLC 法同时分析该制剂中10 个活性成分（即：5-羟甲基糠醛、远志酮Ⅲ、毛蕊花糖苷、3，6’-二芥子酰基蔗糖、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、宝藿苷I）的研究报道。因此笔者欲通过采用HPLC 法测定健脑安神片中的10个活性成分，并进行主成分分析与聚类分析，为产品的质量控制提供科学依据，为进一步研究该制剂在体内药代动力学及组织分布奠定基础。

1 仪器与试药

岛津NexeraXR 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；乙腈（色谱纯，批号：LOT106246）、甲醇（色谱纯，批号：LOT110301），均购于美国Fisher公司；5-羟甲基糠醛（批号：HH248894198）、远志酮Ⅲ（批号：HP124420，纯度≥98.0%）、毛蕊花糖苷（批号：HA141444，纯度为98.0%）、3,6’-二芥子酰基蔗糖（批号：HD124612，纯度为98.0%）、淫羊藿次苷I（批号：HI008679，纯度≥98.0%）、朝藿定A（批号：HE008056，纯度≥98.0%）、朝藿定B（批号：HE008057，纯度≥98.0%）、朝藿定C（批号：HE008058，纯度≥98.0%）、淫羊藿苷（批号：HI008055，纯度≥98.0%）、宝藿苷I（批号：HB008053，纯度≥98.0%），均购于宝鸡辰光生物技术有限公司；健脑安神片（批号：190808-190814，200908-200916，编号为S1-S15；规格：0.21 g ×12片× 3 板/盒，江西药都樟树制药有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采 用Shim-pack Scepter C18色 谱 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.15%甲酸水溶液溶液(A)-乙腈（B），梯度洗脱：0 ～10 min，A 96% → 92%；10 ～45 min，A 92% → 80%；45 ～120 min，A 80% →50%。记录时间：120 min；流速：0.8 mL/min；柱温：20 ℃；检测波长：300 nm；进样量：20 μL。

2.2 混合对照品溶液的配制

2.3 供试品溶液的制备

取本品20 片，除薄膜衣，研细，混匀，称取1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25 mL，称定重量，超声（功率：200 W，频率：40 KHz）处理45 min，取出，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足失重，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液得到供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液的制备

按处方比例[1]分别制成缺淫羊藿、黄精、远志、地黄的模拟制剂，再依据“2.3”项，制备缺淫羊藿的阴性对照溶液（即：朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、宝藿苷I 阴性对照溶液）、缺黄精的阴性对照溶液（即：5-羟甲基糠醛阴性对照溶液）、缺远志的阴性对照溶液（即：远志酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖阴性对照溶液）、缺地黄的阴性对照溶液（即：毛蕊花糖苷阴性对照溶液）。

2.5 线性关系考察

分别精密量取储备液0.01、0.05、0.25、0.50、0.75 mL置于1 mL容量瓶中，分别加甲醇定容，混匀，即得系列混合对照溶液。用0.45 μm 微孔滤膜滤过，进样。以各对照品的浓度（μg/mL）为横坐标（X），峰面积值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，进行线性回归。线性回归方程、线性范围及相关系数r，见表1。结果表明，10 种对照品在相应浓度范围内线性关系良好。

表1 对照品的线性方程与浓度范围及相关系数Tab.1 Linear equations and their concentration range of the reference substance

2.6 专属性试验

分别精密量取混合对照溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20 μL 进样，分别记录色谱图，实验结果见图1。结果表明阴性对照无干扰，专属性强。

图1 混合对照、供试品与阴性对照HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of mixed control, test substance and negative control

2.7 精密度试验

精密吸取“2.3”项下制备的供试品溶液（批号：200908），重复进样6 次，结果测得5-羟甲基糠醛、远志酮Ⅲ、毛蕊花糖苷、3, 6’-二芥子酰基蔗糖、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、宝藿苷I 峰面积的RSD 值分别为1.02%、0.87%、1.16%、1.05%、0.88%、0.95%、0.81%、0.94%、1.21%、1.34%，表明精密度良好。

2.8 稳定性试验

精密吸取“2.3”项下制备的供试品溶液（批号：200908），在第0、3、6、9、16、24 h 进样。结果5-羟甲基糠醛、远志酮Ⅲ、毛蕊花糖苷、3, 6’-二芥子酰基蔗糖、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、宝藿苷I 峰面积的RSD 值分别为1.24%、1.18%、1.25%、1.32%、1.15%、1.09%、1.16%、1.23%、1.14%、1.39%，表明该溶液在24 h内稳定。

2.9 重复性试验

精密称取样品（批号：200908）6 份，分别按“2.3”项下方法制备供试品，按“2.1”项下条件测定。测得5-羟甲基糠醛、远志酮Ⅲ、3, 6’-二芥子酰基蔗糖、毛蕊花糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、宝藿苷I 平均含量的RSD 值分别为2.11%、1.49%、0.85%、1.62%、1.93%、1.04%、0.87%、1.09%、 1.76%、1.85%，表明该法重复性良好。

2.10 加样回收率试验

取本品（批号：200908）内容物，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定，重复制样6 份，结果见表2，表明该方法回收率良好。

表2 加样回收率试验结果Tab.2 Test results of sample recovery

2.11 含量测定

精密称取10 批样品，分别按“2.3”项下方法制备供试品，按“2.1”项下条件测定。5-羟甲基糠醛、远志酮Ⅲ、3,6’ -二芥子酰基蔗糖、毛蕊花糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I 及宝藿苷I 的含量及RSD 值见表3。

表3 15 批健脑安神片中10 种成分含量试验结果Tab.3 Test results of 10 components in 15 batches of Jiannaoanshen tablets

2.12 聚类分析

运用SPSS 26.0 软件，以15 批次健脑安神片10种功效成分的含量为数据样本，采用组间联接法，以平方欧氏距离为测度，进行系统聚类分析[20-21]，结果见图2。依据聚类分析树状图，当类间距离为20 时，15 批样品可聚为2 类，S5、S15、S6、S4、S14、S2、S12、S8、S9 为第I 类，S3、S13、S1、S11、S7、S10为第Ⅱ类；当类间距离为15 时，15 批样品可聚为3类，S5、S15、S6、S4、S14、S2、S12、S8、S9 为 第Ⅰ类，S3、S13、S1、S11、S7 为第Ⅱ类，S10 为第Ⅲ类；当类间距离小于10 时，分为4 大类，S5、S15、S6、S4、S14 为 第Ⅰ类，S2、S12、S8、S9 为 第Ⅱ类，S3、S13、S1、S11、S7 为第III 类，S14 为第IV类。结果显示健脑安神片中所测10 种成分的含量差异可能与健脑安神片生产所用原药材的种属来源、产地、生长年限、采收季节及加工炮制方式等因素有关。

图2 15 批健脑安神片聚类分析树状图Fig.2 Cluster analysis tree diagram of 15 batches of Jiannaoanshen tablets

2.13 主成分分析

采用SPSS 26.0 软件对15 批次健脑安神片中10 种成分进行主成分分析[10-11]，主成分特征值和方差贡献率见表4，初始因子载荷矩阵见表5。由表4 可知，以累计方差贡献率 > 87%，初始特征值>1 为提取标准，前四个主成分初始特征值分别为：3.224、2.517、1.703、1.353，对应方差贡献率分别为32.236%、25.168%、17.030%、13.535%。由表5 可知，朝藿定A、淫羊藿次苷I、毛蕊花糖苷、3, 6’-二芥子酰基蔗糖对主成分1 贡献率高，毛蕊花糖苷、远志酮Ⅲ、宝藿苷I、淫羊藿苷对主成分2 贡献率高，淫羊藿苷、朝藿定C、远志酮Ⅲ对主成分3 贡献率显著，5-羟甲基糠醛、远志酮Ⅲ对主成分4 贡献率显著。各成分数与特征值的关系可通过PCA 碎石图表示，见图3。

图3 样品PCA 碎石图Fig.3 PCA scree plot of various samples

表4 主成分方差分析Tab.4 Analysis of variance for PCA

表5 初始因子载荷矩阵Tab.5 Initial factor load matrix

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

使用二极管阵列检测器对健脑安神片样品进行全波长扫描，结果表明10 个成分的最大吸收波长分别为：5-羟甲基糠醛（284 nm）、远志酮Ⅲ与3, 6’-二芥子酰基蔗糖（302 nm）、毛蕊花糖苷（330 nm）、朝藿定A 和朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I 及宝藿苷I（270、319 nm），因此，将300 nm作为10 种成分的检测波长。本品为中药复方，成分复杂，所以采用梯度洗脱；比较选择不同流动相系统如：乙腈-磷酸水（0、0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%）、甲醇-水（0、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%）、乙腈-醋酸水（0.10%、0.20%、0.50%）、乙腈（或甲醇）-甲酸水（0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.50%）等，比较不同柱温（20、30、35℃）、不同流速（0.5、0.6、0.8、0.9、1.0 mL/min）；结果表明色谱条件（流动相为乙腈-0.15%甲酸水进行梯度洗脱，柱温为20℃，流速为0.8 mL/min）具有较好分离度及较为理想的峰形等优势，故将此条件作为检测色谱条件。

3.2 供试品制备方法

本制剂制由生药粉、水提物及醇提物等制成[1]。研究比较了提取溶剂如：甲醇（0、50%、70%、100%），乙醇（0、50%、70%、95%）；提取方法如：回流提取（30、45、60 min），超声提取（15、30、45、60 min）等。结果表明超声处理制备方法操作简便、色谱信息丰富，明显优于加热回流制备方法；选择50%甲醇作为提取溶剂目标物色谱峰峰面积大，优于其它溶剂及浓度；超声处理时间小于45 min 目标物色谱峰峰面积较小；大于45 min 目标物色谱峰峰面积并没有增加。综合上述各因素选择50%甲醇超声处理45 min 作为供试品制备方法，该方法具有色谱峰信息理想、分离度好等优点。

3.3 专属性实验

黄精含有5-羟甲基糠醛，所以制备阴性对照供试品时需要减去黄精；毛蕊花糖苷仅在地黄中含有，制备阴性对照时需要去掉地黄；远志中含有远志酮Ⅲ与3, 6’-二芥子酰基蔗糖，故制备阴性对照时需要去掉远志；淫羊藿中含有朝藿定A 和朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I 及宝藿苷I，所以制备阴性对照供试品时需要减去淫羊藿。

3.4 主成分与聚类分析

通过对健脑安神片中所测10 种成分的含量聚类分析，分为两大类，含量差异可能与健脑安神片生产所用原药材的种属来源、产地、生长年限、采收季节及加工炮制方式等因素有关。主成分分析显示，前4个主成分基本可反映各成分全部信息，能以其对样品质量进行控制，其中，主成分1 主要反映朝藿定A、毛蕊花糖苷、3, 6’-二芥子酰基蔗糖含有量信息，主成分2 主要反映朝藿定A、宝藿苷I、淫羊藿次苷I、毛蕊花糖苷、远志酮Ⅲ、朝藿定C 含有量信息，主成分3 主要反映淫羊藿苷、朝藿定C、朝藿定B含有量信息，而主成分4 主要反映5-羟甲基糠醛、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、远志酮Ⅲ成分含有量信息。

4 结论

本实验建立了15 批健脑安神片样品中10 种成分的HPLC 含量测定方法，该方法操作简单、准确、稳定、重复性好、专属性强，可用于健脑安神片的质量控制，同时10 种成分的定量分析也为临床用药提供科学依据。