赵宇萌，陈吉聪，肖洪贺，田 雨，李 贺，田晋明，杨静娴

（辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种常见的神经退行性疾病，病理表现为大脑皮层和海马区出现老年斑、神经纤维缠结和神经元丢失。在AD 早期患者的脑内普遍存在过量的活性氧，这将导致细胞膜的脂质过氧化，进而促进细胞外Aβ 的沉积和细胞内tau 蛋白的异常磷酸化，从而影响突触功能，加速AD 进程，导致神经元凋亡[1]。尽管国内外现有药物能部分缓解AD 症状，但无法有效改善脑内的过氧化状况，且长期使用均存在一定的副作用。因此，建立一种消除脑内过多氧自由基的新方法对治疗AD 具有重要意义。

核因子E2 相关因子2（Nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）是机体内重要的氧化应激调控蛋白。过度的氧自由基会激活Nrf2，使其由胞浆向核内转移，同时诱导血红素氧合酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）的表达[2]。HO-1 是机体内主要的抗氧化蛋白，可以促进血红素的降解以及胆绿素的生成，并清除氧化还原失衡所积累的自由基，从而发挥抗氧化作用[3]。

人参皂苷Rg1（Ginsenoside Rg1，Rg1）是中药人参的主要活性成分之一，相关研究表明，其具有增强免疫、神经保护、抗氧化等多重生物活性[4]。另外，本课题组前期研究结果显示[5]，以Rg1 为主要药效成分的参枣健脑口服液能有效改善APP/PS1 小鼠的学习记忆能力并促进脑内神经再生。基于以上研究结果，推测Rg1 能通过抑制氧化应激损伤，改善脑内微环境来发挥抗AD 的作用。因此，本实验利用H2O2诱导小鼠神经瘤母细胞构建体外细胞模型，采用Western Blot、免疫荧光染色等方法进一步探究Rg1 对H2O2-N2a 的影响，从而为其治疗AD 提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 人参皂苷Rg1（四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq19040208）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批号：19110505）；青-链双抗（美国Hyclone 公司，批号：J190007）；Caspase3 抗 体（批号：WL02117）、Nrf2 抗体（批号：WL02135）、HO-1 抗 体（ 批 号：WL02400），GAPDH 抗体（批号：WL01114）、HRP 标记山羊抗兔lgG （批号：WLA023）、山羊抗兔CyTM3 标记二抗、Hoechst33258 染色液（批号：WLA036a）均购自沈阳万类生物技术有限公司；CCK-8 细胞增殖检测试剂盒（G021-1）、乳酸脱氢酶试剂盒（A020-2-2）、总超氧岐化酶测定（LDH）试剂盒（A001-1-2）和丙二醛（MDA）测定试剂盒（A033-1-2）均购自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 实验仪器 Ti-S 型倒置荧光显微镜（日本尼康株式会社）；C00I01HW 型CO2培养箱（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；MR-96A 型酶标仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；SH-510 型凝胶成像系统（杭州申花科技有限公司）。

1.1.3 实验细胞 小鼠神经瘤母细胞（N2a）购于赛业（苏州）生物科技有限公司，批号：210409G61。在37℃、5% CO2条件下，用含10%胎牛血清、1% P/S的高糖DMEM培养基培养N2a细胞，选择对数生长期细胞进行实验。

实验分为对照组、模型组、给药组。对照组不进行处理；模型组加入浓度为500 μmol/L 的H2O2；给药组加入50 μmol/L 的人参皂苷Rg1，同时给予浓度为500 μmol/L 的H2O2，继续培养24 h 后进行检测。

1.2 实验方法

1.2.1 CCK-8 法检测细胞活力 取N2a 细胞以5×103个/孔的密度接种于96 孔板中，待细胞贴壁后，给药组分别加入不同浓度的Rg1（6.25、12.5、25、50、100 μmol/L）预保护24 h 后，模型组和给药组给予H2O2（500 μmol/L）孵化5 h[6-9]，之后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37℃孵育2 h，并用酶标仪在450 nm 处检测各组细胞的吸光度，绘制量效曲线。

1.2.2 Hoechst 33258 染色法检测细胞凋亡率 取N2a 细胞以5×103个/孔的密度接种于96 孔板中，待细胞贴壁后，给药组加入浓度为Rg1（50 μmol/L），药物预保护24 h后，模型组和给药组更换成H-DMEM基础培养基，加入H2O2（500 μmol/L）孵育5 h。培养结束后，弃去培养基，加入100 μL 4%多聚甲醛溶液固定细胞10 min。弃去固定液，PBS 清洗3 min，重复两次。再加入500 μL Hoechst 33258 染色液，置于摇床上染色5 min。弃去染色液，PBS 清洗3 min，重复两次，使用抗淬灭封片液封片，荧光显微镜下拍照观察。

1.2.3 免疫荧光细胞化学法检测Caspase 3 的表达

细胞分组、接种方法、给药方法同 “1.2.2”，培养结束后，各组细胞用4%多聚甲醛固定30 min，PBS 清洗3 次，每次5 min，0.5% Triton 室温下透化5 min；PBS 洗 涤3 次， 每 次5 min。 随 后 加 入Caspase 3 一抗孵育，4 ℃过夜。次日弃去液体，PBS清洗，再用CyTM3 标记二抗室温孵育60 min；PBS洗涤3 次，每次5 min；加入DAPI 染色液（1 ∶10）避光反应2 min，PBS 洗涤3 次，每次5 min，荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.4 LDH 释放量的检测 细胞分组、接种方法、给药方法同 “1.2.2”，培养结束后，吸出96 孔板中各组细胞的培养基于1.5 mL 的EP 管中，4℃，3 000 r/min离心5 min，吸取上清液，并根据LDH 试剂盒使用说明进行检测。

1.2.5 抗氧化指标的检测 细胞分组、接种方法、给药方法同 “1.2.2”，培养结束后，弃培养基，每孔加入100 μL 1%，Triton 溶液破碎细胞30 min，随后反复冻融细胞3 次，将溶液转移至EP 管中，4℃，1 500 r/min，取上清液，按照试剂盒的说明测定SOD活性和MDA 含量。

1.2.6 检测Nrf2 和HO-1 蛋白表达 细胞分组、接种方法、给药方法、细胞透化同“1.2.3”，每空加入Nrf2 和HO-1 一抗（1 ∶150），4 ℃孵育过夜。次日弃去液体，PBS 清洗，再用CyTM3 标记的二抗（1 ∶200）室温孵育60 min；PBS 洗涤3 次，每次5 min；加入DAPI 染色液（1 ∶10）避光反应2 min，PBS洗涤3次，每次5 min，荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.7 Western Blot 法检测Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平 取N2a 细胞以1×105个/mL 的密度接种于6孔板中，细胞分组、给药方法同“1.2.2”，培养结束后，弃培养基，预冷的PBS 洗涤3 次，根据全蛋白试剂盒说明书提取蛋白，根据BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量并调整蛋白浓度；两端各加入5 μL 预染的Marker，122 V 恒压电泳90 min，当指示剂达到分离胶底部停止电泳[10]，转膜后，使用5%的脱脂牛奶室温封闭2 h，加入Nrf2、HO-1 和GAPDH 一抗抗体，4 ℃过夜，次日，将PVDF 膜用TBST 液清洗后，孵育二抗，TBST 洗膜3 次，用超敏ECL 化学发光试剂盒显色，用Image J 图像分析软件对条带扫描；以GAPDH 作为内参，分析目的蛋白表达。

1.2.8 统计学方法 用SPSS 22.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 Rg1 改善H2O2-N2a 的细胞形态并促进存活

模型组细胞在给予500 μmol/L H2O2损伤5h 后，与对照组相比，细胞存活率明显下降（P< 0.01）。而经不同浓度Rg1 预保护24 h 后，与模型组相比，各给药组细胞存活率均有不同程度的提升；其中，25、50 μmol/L Rg1 组更明显（P< 0.05）。根据实验结果，选择50 μmol/L Rg1 预保护24 h 进行后续实验。光镜下可见，对照组细胞胞体饱满，生长状态良好，模型组细胞胞体皱缩，存在凋亡情况；而经过50 μmol/L Rg1 预保护24 h 后，细胞形态有所改善，凋亡细胞数目减少，见图2。以上结果证明，Rg1 预保护能改善H2O2-N2a 的细胞形态并促进存活。

图1 不同浓度Rg1 对H2O2 诱导N2a 细胞的保护作用（n = 6）Fig.1 Protective effect of different concentrations of Rg1 on H2O2 induced N2a cell damage （n = 6）

图2 Rg1 对细胞影响的光镜图Fig.2 Microscopic view of the effect of Rg1 on cells

2.2 Rg1 减少H2O2-N2a 的凋亡

LDH 释放量的结果见图3，模型组细胞在给予H2O2损伤后，与对照组相比，LDH 的释放量明显升高（P< 0.01），而经50 μmol/L Rg1 预保护24 h后，与模型组相比，给药组LDH 的释放量下降（P<0.01）。使用Hoechst 33258 染色以及免疫荧光化学染色进一步验证Rg1 的抗凋亡作用。Hoechst 33258 染色结果见图4、图5，细胞损伤后，与对照组相比，模型组凋亡发生率明显上升（P< 0.01）；而经Rg1预保护后，给药组细胞凋亡率较模型组相比明显下降（P< 0.01）。Caspase 3 是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，Caspase 3 表达的升高意味着细胞逐渐趋于凋亡。与对照组相比，模型组Caspase 3 阳性细胞率明显上升（P< 0.01），而给予Rg1 预保护后，给药组细胞内Caspase 3 阳性细胞率较模型组相比明显下降（P< 0.01），见图6、图7。综上所述，Rg1能有效减少H2O2-N2a 的凋亡。

图3 LDH 释放量统计图（n = 6）Fig.3 Statistical plot of LDH release（n = 6）

图4 Hoechst 33258 法检测细胞凋亡Fig.4 Detecting cell apoptosis by Hoechst 33258

图5 Hoechst 33258 统计图（n = 6）Fig.5 Statistical plot of Hoechst 33258 （n = 6）

图6 免疫荧光染色法检测Caspase 3 阳性细胞的表达Fig.6 Immunofluorescence staining detect the expression of Caspase 3 positive cell

图7 Rg1 对Caspase 3 阳性细胞率统计图（n = 6）Fig.7 Statistical plot of Caspase 3 positive cell rate（n = 6）

2.3 Rg1 抑制H2O2-N2a 的氧化应激损伤

MDA 是脂质氧化的终产物，反映机体脂质过氧化的程度。SOD 是生物体内重要的抗氧化酶，是生物体内清除自由基的首要物质。因此测定MDA 和SOD 可有效的放映细胞的氧化应激状态。与对照组相比，模型组细胞在与给予H2O2损伤后，MDA 含量明显上升，SOD 活性明显降低（P< 0.01）；而经Rg1 预保护后，与模型组相比，细胞内MDA 的含量下降，SOD 的活性有所上升（P< 0.05），见图8。根据以上结果，认为Rg1 能有效抑制H2O2-N2a 的氧化应激损伤。

，图8 Rg1 对MDA、SOD 影响的统计图（n = 6）Fig.8 Statistical plot of Rg1 effect on MDA and SOD（n = 6）

2.4 Rg1 对N2a 细胞Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平的影响

为了探讨Rg1 抑制H2O2诱导的N2a 细胞氧化损伤作用的机制，我们采用免疫荧光化学法和Western Blot 法检测Nrf2 和HO-1 的表达情况。免疫荧光结果见图9 -图12，给予H2O2损伤后，与对照组相比模型组细胞Nrf2 和HO-1 的表达量减少（P< 0.01），而给予Rg1 后，细胞内Nrf2 和HO-1 的表达水平明显上升（P< 0.05，P< 0.01）。Western Blot 结果见图13、图14，与对照组相比，模型组细胞Nrf2 和HO-1 的表达明显降低（P< 0.01）；而与模型组相比，给予Rg1 后，细胞内Nrf2 和HO-1 的表达明显增加（P< 0.05，P< 0.01）。

图9 免疫荧光染色法检测Nrf2 阳性细胞的表达Fig.9 Immunofluorescence staining detect the expression of Nrf2positive cell

图10 Nrf2阳性细胞率统计图（n = 6）Fig.10 Statistical plot of Nrf2 positive cell rate（n = 6）

图11 免疫荧光染色法检测HO-1 的表达Fig.11 Immunofluorescence staining detect the expression of HO-1

图12 Rg1 对HO-1 阳性细胞率统计图（n = 6）Fig.12 Statistical plot of HO-1 positive cell rate（n = 6）

图13 Western Blot 条带图Fig.13 Western Blot strip plot

图14 Nrf2、HO-1 相对表达量的统计图（n = 3）Fig.14 Statistical plot of relative expression levels of Nrf2 and HO-1（n = 3）

3 讨论

由于目前AD 的发病机制尚未完全阐述清楚，使得AD 体外细胞模型的构建呈现多样性。众多研究表明，氧化应激参与AD 的病理过程，能够导致神经元凋亡并加速AD 的产生。H2O2是机体内常见的活性氧，被认为是神经元凋亡的启动剂，N2a 细胞具有神经干的特性，常被用于研究神经退行性疾病，因此本实验采用H2O2损伤N2a 建立氧化应激损伤模型。

文献报道显示，Rg1 对脑缺血和血管性痴呆大鼠的认知功能障碍具有明显改善作用，可以抑制海马CA1 区细胞凋亡[11]，说明Rg1 具有良好的神经保护作用。实验结果证实，Rg1 能提升H2O2-N2a 细胞的存活率并降低其LDH 的释放量，具有明显的神经保护作用。

为明确Rg1 对H2O2-N2a 细胞氧化应激的影响，实验检测了MDA 的含量和SOD 的活性，发现模型组细胞的MDA 含量增高，SOD 活性降低，细胞抗氧化水平降低，而Rg1 可有效降低MDA 含量，增加抗氧化物的活性，使细胞氧化与抗氧化保持平衡，保护细胞免受氧化应激损伤。为了进一步探究其作用机制，通过Western Blot 及免疫荧光检测Nrf2 及其下游HO-1 蛋白的表达，发现Rg1 能够明显增加H2O2损伤后总Nrf2 及HO-1 的表达，表明Rg1 可以通过激活Nrf2/HO-1 信号通路抑制神经细胞的氧化应激反应。

4 结论

本实验通过H2O2诱导N2a 构建体外细胞氧化损伤模型，探讨Rg1 对AD 神经细胞的保护作用。研究证明Rg1 能通过激活Nrf2/HO-1 信号通路抑制H2O2-N2a细胞的氧化应激损伤，发挥神经保护作用。从机体氧化平衡角度出发，为Rg1 用于治疗AD 提供了实验基础。另外，Rg1 通过抑制神经细胞氧化应激损伤发挥抗AD 作用的结果仍有待利用动物模型进一步验证。