UPLC-Q-TOF-MS 法分析大青龙汤化学成分

2022-03-19孙国东刘华石霍金海王伟明

现代中药研究与实践 2022年1期

袁梦，孙国东，刘华石，霍金海，王伟明

（黑龙江省中医药科学院，黑龙江哈尔滨 150036）

大青龙汤出自《伤寒论》，为解表剂，方中麻黄、桂枝、生姜辛温发汗，散风寒，泄内热；甘草、生姜、大枣调和营卫，补热伤之津；石膏清解里热，诸药配伍，寒热并用，表里同治，发中寓补，祛邪而不伤正[1]，是治疗太阳病兼有里证的经典名方，具有辛温解表之功，可解热、镇痛、抗病毒，临床常用于治疗流感、暑热、急性肾炎等症，尤善治疗小儿哮喘，其机制可能与改善患儿免疫失衡状态，降低患儿炎性反应，从而快速改善患儿临床症状有关[2-3]。

大青龙汤作为一剂名方，应用广、疗效佳，但其成分复杂，尚无明确质量评价指标，且化学物质组成尚不明确，无法对其药效物质基础进行深入研究。近年来，超高效液相色谱飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）技术在中药分析方面的应用越来越广，其集分离与分析于一体，高分辨率、高灵敏度的特点使成分分析更加准确、全面。本研究利用UPLC-QTOF-MS 技术，快速分析推断出大青龙汤的化学成分，以期为其药效物质基础提供溯源依据。

1 材料

1.1 仪器

ACQUITYTTM型UPLC 色谱仪、Triple-TOFTM5600+ 型质谱仪（USA AB SCIEX 公司）；ST16R型低温高速离心机（USA Thermofisher Scientific 公司）；BSA224S-CW 型、BP211D 型电子天平（GER Sanorius 公司）；KQ-300DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂

甲醇、乙腈（色谱纯，GER Merck 公司）；甲酸（色谱纯，USA Fisher 公司）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。

1.3 中药饮片

麻黄（批号：210315）、桂枝（批号：210112）、炙甘草（批号：201213）、苦杏仁（批号：210226）、生石膏（批号：210123）饮片均购于北京同仁堂饮片有限公司；生姜（批号：210401）、大枣（批号：210501）饮片均购于黑龙江德顺长中药饮片有限公司，经黑龙江省中医药科学院霍金海研究员鉴定均符合规定。

1.4 大青龙汤样品的制备

取“1.3”项下中药饮片，麻黄18 g，加1 800 mL水，先煮30 min，再加入其它6 味药（桂枝6 g，炙甘草6 g，苦杏仁24 g，生姜9 g，大枣10 枚，生石膏18 g），煮3 h，药液离心，取上清液浓缩至150 mL，将浓缩液冷冻干燥制成冻干粉。

2 方法

2.1 色谱条件

Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）、Van Guard Pre-Column 预柱（2.1 mm × 5 mm，1.7 μm）；柱温：35℃；流动相A 为0.1%甲酸水，B 为0.1%甲酸乙腈，梯度洗脱（0 ～22 min，95%→48%A；22 ～23 min，48%→0%A；23 ～23.1 min，0%→95% A；23.1 ～25 min，95% A），体积流量：0.3 mL/min；样品仓温度：4 ℃；进样量：5 μL。

2.2 质谱条件

采用ESI 离子源，离子化模式为电喷雾正、负离子模式；正、负离子源电压分别为5 500 V、-4 500 V，离子源温度550 ℃，裂解电压（DP）为80 V 和-80 V，碰撞能量（CE）为40 eV 和-40 eV，碰撞能量扩展（CES）为20 eV；雾化气体N2，辅助气Gas为55 PSI，辅助气Gas2 为55 PSI，气帘气CurGas 为35 PSI。一级质谱母离子扫描范围为80 ～ 1 600 Da，IDA 设置响应值超过100 cps 的8 个最高峰进行二级质谱扫描，Product Ion 扫描范围为50 ～ 1 500 Da，开启动态背景扣除（DBS）。数据采集软件为Analyst TF1.6 Software（USA AB SCIEX 公司），数据处理软件为Peakview 2.0（USA AB SCIEX 公司）。

2.3 供试品溶液制备

精密称定大青龙汤冻干粉1 g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷至室温，用甲醇补足减失的质量，摇匀，5 000 r/min 离心10 min，取上清液，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.4 单味药及阴性样品溶液制备

按“2.3”项下制备方法，制备麻黄、桂枝、炙甘草、苦杏仁、生姜、大枣、生石膏单味药样品，以及缺少这7 味药的阴性样品。分别取以上7 味药单味药样品粉末1 g，按“2.3”项下方法制备相应溶液；分别取以上阴性样品粉末1 g，按“2.3”项下方法制备相应阴性样品溶液。

2.5 数据分析

查阅大青龙汤中中药材的化学成分相关文献资料[4-9]，并结合TCMSP 数据库，建立整理出化学成分数据列表，将所有化合物分子式导入Peakview 2.0，推测各色谱峰对应化合物的分子式；使用Natural Products HR-MS/MS Spectral Library 1.0 Software（USA AB SCIEX）进行筛查，该数据中对照品的二级谱图信息与样品中的化合物进行自动匹配，确认推断成分。无法获得对照品的化合物，先依据MS/MS碎片信息，计算出每一个二级碎片的元素组成，推测其裂解方式，再解析化合物结构。

3 结果

3.1 大青龙汤UPLC-Q-TOF-MS 色谱图采集

在“2.1”“2.2”项条件下分析样品，正、负离子扫描模式下各成分的分离度及离子化程度均较好，总离子流图见图1、图2。

图1 正离子模式下大青龙汤总离子流图Fig.1 TIC of Daqinglong decoction in ESI+

图2 负离子模式下大青龙汤总离子流图Fig.2 TIC of Daqinglong decoction in ESI-

3.2 大青龙汤化学成分分析与表征

共分析和表征出96 个化合物，对比单味药及阴性对照样品，其中，26 个来自麻黄，9 个来自桂枝，22 个来自甘草，13 个来自苦杏仁，2 个来自生姜，2个来自大枣。另有3 个为麻黄、大枣共有，1 个为麻黄、甘草共有，1 个为麻黄、大枣、甘草共有，8 个为麻黄、桂枝共有，4 个为麻黄、苦杏仁共有，2 个为麻黄、桂枝、苦杏仁共有，1 个为桂枝、苦杏仁共有，2 个为苦杏仁、甘草共有。具体见表1。

表1 大青龙汤主要化学成分Tab.1 Main chemical constituents of Daqinglong decoction

续表1

3.3 主要类别化合物的鉴定及裂解规律研究

3.3.1 生物碱类麻黄发挥平喘作用的主要有效成分为总生物碱[4]，麻黄碱作为麻黄的标志性成分，可作用于支气管平滑肌，具有较好的解痉效果，以达到止咳、平喘的作用。麻黄碱在正离子模式下，准分子离子峰m/z166[M+H]+脱掉一个H2O，得到碎片离子m/z148[M+H-H2O]+，碎片离子脱掉一个CH3，得到碎片离子m/z133[M+H-H2O-CH3]+；碎片离子m/z148[M+H-H2O]+，脱掉一个CH3NH2，得到碎片离子m/z117[M+H-H2O-CH5N]+，参考麻黄碱碎片离子（m/z）[10-11]，对照标准品二级质谱镜像图，见图3，根据生物碱类成分的裂解规律可推测该化合物为麻黄碱，裂解碎片数据见图4。

图3 麻黄碱正离子模式下二级质谱图与标准品比对镜像图Fig.3 Mirror image of comparison between secondary mass spectrogram and standard substance of ephedrine in ESI+

图4 麻黄碱裂解途径Fig.4 The fragmentation pathway of ephedrine

3.3.2 苯丙素类甘草作为传统常用中药，具有补脾益气、祛痰止咳、调和诸药之功效，甘草中的苯丙素类化合物，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、调节免疫、抗纤维化等多种药理活性[12]。甘草香豆素在正离子模式下，准分子离子峰m/z369[M+H]+脱掉一个C4H8，得到碎片离子m/z313[M+H-C4H8]+，碎片离子脱掉一个CO，得到碎片离子m/z285[M+H-C4H8-CO]+，之后脱掉一个CH3，得到碎片离子m/z270[M+H-C4H8-CO-CH3]+，再脱掉一个CO，得到碎片离子m/z242[M+H-C4H8-2CO-CH3]+，参考苯丙素类的碎片离子（m/z）[13]，对照该化合物二级质谱图，见图5，根据苯丙素类成分的裂解规律可推测该化合物为甘草香豆素，裂解碎片数据见图6。

图5 甘草香豆素正离子模式下二级质谱图Fig.5 Secondary mass spectrum of glycycoumarin in ESI+

图6 甘草香豆素裂解途径Fig.6 The fragmentation pathway of glycycoumarin

3.3.3 黄酮类黄酮类成分是甘草中的成分之一，甘草苷在正离子模式下裂解途径如下：其准分子离子峰m/z419[M+H]+失去一个脱水葡萄糖中性分子，得到一个基峰碎片离子m/z257[M+HC6H10O5]+，基峰碎片离子脱掉一个H2O，得到碎片离子m/z239[M+H-C6H10O5-H2O]+，碎片离子脱掉一个CO，产生碎片离子m/z211[M+H-C6H10O5-H2O-CO]+；碎片离子m/z239[M+H-C6H10O5-H2O]+脱掉一个C6H4O，得到碎片离子m/z147[M+HC6H10O5-H2O-C6H4O]+；基峰碎片离子m/z257[M+HC6H10O5]+经逆狄尔斯-阿尔德反应（RDA）裂解后产生碎片离子m/z137[M+H-C6H10O5-C8H8O]+和m/z119[M+H-C6H10O5-C7H4O3]+，参考甘草苷碎片离子（m/z）[14]，对照标准品二级质谱镜像图，见图7，根据黄酮类成分的裂解规律可推测该化合物为甘草苷，裂解碎片数据见图8。

图7 甘草苷正离子模式下二级质谱图与标准品比对镜像图Fig.7 Mirror image of comparison between secondary mass spectrogram and standard substance of liquiritin in ESI+

图8 甘草苷裂解途径Fig.8 The fragmentation pathway of liquiritin

3.3.4 三萜类甘草酸是甘草、苦杏仁的共有成分，属于三萜皂苷类，在正离子模式下，其准分子离子峰m/z823[M+H]+，脱去一个糖醛酸，得到碎片离子m/z647[M+H-C6H8O6]+，又脱去一个糖醛酸，得到碎片离子m/z471[M+H-2C6H8O6]+，碎片离子又脱掉一个H2O，得出基峰碎片离子m/z453[M+H-2C6H8O6-H2O]+，参考甘草酸的碎片离子（m/z）[15]，对照标准品二级质谱镜像图，见图9，根据三萜类成分的裂解规律可推测该化合物为甘草苷，裂解碎片数据见图10。

图9 甘草酸正离子模式下二级质谱图与标准品比对镜像图Fig.9 Mirror image of comparison between secondary mass spectrogram and standard substance of glycyrrhizic acid in ESI+

图10 甘草酸裂解途径Fig.10 The fragmentation pathway of glycyrrhizic acid

4 讨论

通过与部分对照品数据信息及二级质谱图的比较，最终分析和推断出大青龙汤中的96 个化合物，其中，生物碱类10 个、苯丙素类14 个、黄酮类30 个、有机酸类12 个、三萜类15 个，此外还有少数其它类型化合物。

麻黄中主要含有生物碱及黄酮类化合物，生物碱具有止咳平喘、镇痛等作用，麻黄与桂枝的配伍，使麻黄中的生物碱成分与桂枝中苯丙素类成分的含量有了改变，其抗炎、解热作用较单味药增强[16]；方中的黄酮类化合物主要来自麻黄和甘草，甘草中的黄酮类成分有明显抗炎、抗菌、抗肿瘤的作用，其机制可能与免疫调节有关，广泛用于治疗肝损伤、抗肿瘤等症[17]，甘草酸类成分具有平喘、止咳、抗病毒等作用[18]；苦杏仁中的苦杏仁苷可能通过抑制前列腺素与一氧化氮的产生来平喘镇咳、抗炎镇痛[19]。这些物质可能为大青龙汤的药效物质基础。