刘 齐，杨世兴，张 文，齐敦武，付为国

（1.江苏大学农业工程研究院，镇江 212013；2.江苏大学医学院，镇江 212013；3.成都大熊猫繁育研究基地四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室，成都 610081）

林麝（Moschus berezovskii），偶蹄目（Artiodactyla）麝科（Moschidae）麝属（Moschus）动物，俗名獐子，香獐，是国家一级保护动物，雄麝可分泌麝香，具有极高的经济价值[1]。目前林麝患病死亡率极高[2]，已有对一些已知疾病的诊断及预防研究[3]，但缺少对未知病因的研究。

病毒宏基因组学（ viral metagenomics）是宏基因组学的一个分支学科，逐渐应用于医学、环境以及生物检测方面[4]。病毒宏基因组学技术突破了传统检测技术的局限，不仅能研究特定环境范围内的病毒群落组成，还能深度挖掘新型病毒[5-7]。然而，目前以病毒角度研究林麝的报道几乎没有。本文运用病毒宏基因组学方法结合二代测序技术和生物信息学技术，充分利用采集的粪便样本，有效检测出林麝粪便内的新型环状病毒，并对新型环状病毒的特点进行初步分析。

环状病毒（Circovirus）是环形单链DNA（single-stranded DNA,ssDNA）病毒，属于圆环病毒科（Circoviridae），主要编码的蛋白有Rep（Replication）蛋白和Cap（Capsid）蛋白[8-10]。目前已经从人和脊椎动物以及无脊椎动物体内检测到环状病毒[11-15]。

1 材料和方法

1.1 林麝粪便样品的采集 由工作人员使用一次性用具采集林麝粪便样本，避免交叉污染，使用干冰低温运输至实验室，用1.5 mL或2 mL RNase-free离心管从每份粪便样本中取部分，保存于-80℃冰箱备用。

1.2 主要试剂 RNA消化酶及DNA消化酶、文库RNA逆转录试剂盒购自Life Technologie公司；滤菌器0.45 μm cutoff（100×）购自Millipore公司；文库核酸提取试剂盒、文库产物纯化试剂盒购自QIAGEN公司； Klenow大片段DNA聚合酶购自纽英伦生物技术（北京）有限公司公司；文库接头试剂盒购自Illumina公司；文库筛选购自美国贝克曼库尔特有限公司。

1.3 方法 运用病毒宏基因组学的方法构建9个林麝粪便病毒核酸DNA文库，其中5个文库含11份样品，另外4个文库含10份样品。参考文献[16-17]分析病毒宏基因组学DNA文库构建及病毒宏基因组学生物信息学，从而获得环状病毒的全基因组。其具体步骤如下：

1.3.1 样品前处理 加DPBS（dulbecco phophate buffered saline）缓冲液于95份林麝粪便样本中，充分混匀后离心13 000 ×g离心5 min，取上清液，混合获得9个林麝粪便样品池。利用0.45 μm微孔滤膜过滤去除真核及原核细胞后用DNA及RNA消化酶除去样本中无病毒衣壳保护的游离核酸。

1.3.2 文库构建 样品酶消化处理完成后，样品中来自非病毒核酸的比例大大减小，病毒核酸所占的比例得到相应提高，随后依据QIAamp MinElute Virus Spin Kit试剂盒抽提病毒核酸。使用逆转录试剂盒进行逆转录反应，逆转录完成后，使用Klenow酶进行反应合成双链DNA。得到的产物用于构建文库，采用Illumina公司生产的试剂盒（Viral metagenomics）构建病毒宏基因组学高通量测序文库。

1.3.3 文库的纯化 由于测序平台对文库DNA的测序要求是DNA长度介于300～800 bp，所以本研究采用Ampure Beads对文库病毒DNA序列进行筛选以及优化。用产物纯化试剂盒除去文库中的引物二聚体。

1.3.4 生物信息学分析 在Illumina公司测序完毕后，运用病毒宏基因组学实验分析平台对测序所得的原始数据进行生物信息学分析，主要过程为：去除序列里的真核及原核基因组序列，之后，去除序列末端的低质量的序列部分，再去除在建库过程中加入的接头引物序列，最后，将纯净的序列组装拼接形成重叠群，然后blastp搜索，从本地病毒蛋白数据库和本地非病毒蛋白数据库中进行检索，信息以病毒组病毒的网页形式输出，包括病毒群落组成、每段序列所属病毒分类以及与已知病毒相似度以及病毒基因组的覆盖率。最终病毒基因文库信息结果以友好的网页形式界面呈现出来。

1.3.5 病毒全基因组获得 使用Geneious 2019.0.3分析得到新型环状病毒的全基因组序列。用Geneious 2019.0.3和NCBI BLAST分析新型环状病毒的全基因组结构。NCBI blastp找出与该新型环状病毒相近的环状病毒，进行同源性比对。

1.3.6 病毒流行病学调查 使用Geneious 2019.0.3设计巢式P C R引物，F 1（外套上游）：5′-TGGATTTCCCAGTGCCACTC-3′；R1（外套下游）：5′-TGGCATATCGTTAAGTGGGGT-3′；F2（内套上游）：5′-GTACTAGTCTCTGAAAGTT GCTCA-3′；R2（内套下游）：5′-GGTCGCATGTA AAGACACTGC-3′。外套PCR条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，共31个循环；72℃延伸5 min。内套PCR条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共31个循环；最后72℃延伸5 min。1%琼脂糖凝胶电泳目的片段位置为315 bp。

1.3.7 系统发育分析 从GenBank数据库中检索出99个与该新型环状病毒相关病毒毒株的ORF1编码的氨基酸序列。使用Mega 7.0进行序列多重比对以及最大似然法构建系统发育树。

2 结果

2.1 病毒宏基因组学生物信息分析结果 采用病毒宏基因组学的方法，构建林麝粪便样本文库，分析第9个文库的结果。发现一个新型类似环状病毒的序列片段，长为4557 bp，使用Geneious Map to Reference功能拼接获得该病毒环形基因组序列，病毒全长3552 bp，命名为ls-cyc。将其基因组序列提交至GenBank，获得GenBank登录号：MK886724。

2.2 新型林麝环状病毒全基因组结构及分析 序列分析显示，该圆环病毒样（Circovirus-like）病毒ls-cyc全基因组序列GC含量39.00%，包含两个ORF（如图1A所示）。ORF2是最大的开放阅读框，长1953 nt（1572-3172 nt），编码大小为651的衣壳蛋白。ORF1大小为1386 nt（1794～3179 nt）编码一个462 aa的Rep蛋白，该蛋白质与GenBank中其他环状病毒Rep蛋白的氨基酸同源性为32.00%～39.00%。ORF1与ORF2间约 221 nt 的片段中含有一个20 nt的颈环结构（TTGGCTCCCTTAGTATTAAT）（见图1B）。

图1 新型林麝环状病毒全基因组结构图Fig.1 Genomic organization of the novel cyclovirus

2.3 新型林麝环状病毒的系统进化分析 基于Rep蛋白质序列的系统进化树表明，ls-cyc株与来自猪的圆环状病毒（GenBank登录号：MH170058.1）和鸭相关环状病毒（GenBank登录号：NC_030134.1）聚类（如图2所示）。序列相似度分析表明ls-cyc株的Rep蛋白序列与（GenBank登录号：MH170058.1）的Rep蛋白序列相似度最高为34.31%。

图2 新型林麝环状病毒Rep蛋白编码产物氨基酸系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of replication protein

2.4 新型林麝环状病毒流行病学分析 用基于Rep蛋白基因序列设计的巢式PCR引物，对95份林麝粪便样品进行筛选，凝胶电泳结果显示共15份林麝粪便样本呈该环状病毒阳性，其阳性率为15.79%。

3 讨论

圆环病毒（Circovirrus）属于人畜共患病毒，亦可通过昆虫传播感染，主要宿主动物是绵羊、牛、山羊和小型反刍动物[11,18-20]。本研究第一次从林麝粪便中检测到一种新型环状病毒，命名为ls-cyc（GenBank登录号：MK886724），并且获得了该病毒的全基因组序列。研究表明，该病毒基因组为环形，全长为3552 nt，包含两个ORF。其中，ORF1大小为1386 nt（1794～3179 nt），编码一个462 aa的复制相关蛋白。ORF2是最大的开放阅读框，长1953 nt（1572～3172 nt），编码大小为651 aa的蛋白。基于ORF1进行blastp比对，与猪血清相关环状病毒（Porcine serum-associated circular virus，GenBank登录号：MH170058.1）的ORF1的序列相似度最高为34.31%。ORF2则未找到同源性蛋白，推测由于该病毒变异性较高。环状系统进化树分析得ls-cyc右与Cyclovirus聚为一个大的分支，左与Circularvirus、Geminivirus、Genomoviridae聚为一个大分支，其中与来自猪的圆环状病毒（GenBank登录号：MH170058.1）和鸭相关环状病毒（GenBank登录号：NC_030134.1）为聚类最近，推测这一聚类结果与该病毒的结构相关。为研究该病毒在林麝的流行状况，筛选PCR结果显示95份林麝粪便样品中仅有15份呈阳性，说明该病毒在林麝之间并未广泛传播。

本研究首次从林麝体内发现了1株新型环状病毒并分析其基因组序列，对林麝的病毒研究及环状病毒的遗传多样性、宿主适应性及致病性等方面具有重要意义。同时，新型环状病毒的发现为未来潜在的致病性病毒的监测及预警等奠定了重要基础。