刘文霞，王 玮，林松洋，李振红

（郑州安图生物工程股份有限公司研发中心，河南 郑州 450016）

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）目前已被广泛应用于临床诊断等领域，成为医学诊疗活动中不可缺少的技术[1]。然而，当这项技术应用于临床检验中的血液、粪便等复杂生物样本时，PCR抑制物成为结果判读的障碍。PCR抑制物通常来源于样本本身，或来源于收集、处理样本的过程，会显著降低PCR的灵敏度和扩增效率，对检测结果造成干扰，降低结果的准确性。针对PCR抑制物的干扰，添加剂成为解决此问题的有效方法。学者们已发现了越来越多的PCR增强剂，可在不同方面对PCR起促进作用，如提高PCR的特异性、增加PCR扩增的产量及防止无效扩增等[2-3]。在临床检验中，血液中的血红素、尿液中的尿素、粪便中的胆酸盐均对PCR有抑制作用[4]。为此，本研究拟探讨13种PCR增强剂对临床检验中常见的PCR抑制物尿素、胆酸盐和血红素抑制作用的消除效果，以期降低临床PCR检测假阴性结果的概率，提高临床检测准确性。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

从全血样本中提取人基因组DNA后纯化，-20 ℃保存。核酸提取或纯化试剂、全血样本处理试剂及人β珠蛋白基因扩增试剂均购自郑州安图生物股份有限公司。血红素购自国药集团化学试剂有限公司。胆酸盐、尿素、亚精胺、甲酰胺、PEG6000、Tween-20、甜菜碱、海藻糖、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、明胶、硫酸铵、四甲基氯化铵（tetramethylammonium chloride，TMAC）、甘油、Triton X-100购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。Nonidet P 40（NP40）购自湖北佰智昂生物化工有限公司。MILLI-Qreference超纯水机购自默克化工技术（上海）有限公司。AL204电子天平购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。ABI 7500实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA制备 按试剂说明书进行全血样本前处理及人基因组DNA模板的提取和纯化。

1.2.2 荧光PCR扩增体系构建 以提取的人基因组DNA作为模板，扩增β珠蛋白基因中的一段序列，上游引物为5'-GAAGGCTCATGGCAAGAAAG-3'，下游引物为5'-CTCACTCAGTGTGGCAAAGG-3'，探针序列为CTTGAGGTTGTCCAGGTGAGCCAG-CY5。本研究构建了3种荧光PCR扩增体系，具体信息见表1。将构建好的扩增体系在ABI7500实时荧光定量PCR仪上进行扩增，反应条件为：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃22 s，45个循环。扩增完成后；如空白对照组扩增曲线为标准S型曲线，循环阈值（cycle threshold，Ct）为29±1，则本次扩增有效。

表1 3种荧光PCR扩增体系构建信息 μL

1.2.3 抑制物和增强剂的配制 根据预实验结果，使用超纯水配制不同浓度胆酸盐（4.65、6.98 mmol/L）、尿素（0.91、0.99 mol/L）、血红素（6.40、6.98 mmol/L）作为抑制物。使用超纯水配制不同浓度亚精胺（0.16～60.00 mmol/L）、甲酰胺（2.5%～40.0%）、PEG6000（2.5%～40.0%）、NP40（0.6%～10.0%）、Tween-20（2.5%～40.0%）、甜菜碱（0.1～5.0 mol/L）、海藻糖（0.125～1.500 mol/L）、BSA（30～376 mmol/L）、明胶（0.125%～2.000%）、硫酸铵（6.25～100.00 mmol/L）、TMAC（12.5～200.0 mmol/L）、甘油（20%～60%）、Triton X-100（1.25%～20.00%）作为增强剂。所有试剂均置于2～8 ℃储存备用。

1.3 抑制物抑制作用和增强剂抗抑制作用的判定

1.3.1 抑制作用的判定 以PCR中无抑制物的扩增结果作为对照，逐步增加抑制物浓度。当含抑制物的样本Ct值较对照增大1时，判定为扩增受抑制，将无扩增曲线、扩增结果为“无Ct值”（Ct=0）时的最小抑制物浓度确定为抑制物的工作浓度。含抑制物的样本占对照样本扩增平台期荧光强度的百分比=含抑制物的样本扩增平台期荧光强度/对照样本扩增平台期荧光强度×100%，其中扩增平台期荧光强度可从ABI 7500实时荧光定量PCR仪上的该次实验扩增曲线图中读出。如含抑制物样本的Ct值与对照样本相同，但百分比低于对照样本，说明抑制作用仍存在。

1.3.2 抗抑制作用的判定 在模板DNA中分别加入工作浓度的抑制物和5 μL不同浓度的13种增强剂，以不加入增强剂且含有相应工作浓度抑制物的样本作为对照。以与对照样本相比扩增曲线平台期的荧光强度显著提高、由无Ct值变为有Ct值或Ct值高于对照样本为标准（对照样本无扩增曲线），判断增强剂对胆酸盐、尿素和血红素的抗抑制作用。

2 结果

2.1 抑制物工作浓度确认

胆酸盐、尿素和血红素的工作浓度分别为6.98 mmol/L、0.99 mol/L、6.98 mmol/L。见表2。

表2 抑制物工作浓度的确认

2.2 增强剂对PCR抑制物的影响

6.5 mmol/L亚精胺、20%甘油可消除6.98 mmol/L胆酸盐对PCR的抑制作用，6.5 mmol/L亚精胺、100 mmol/L硫酸铵、0.2 mol/L甜菜碱可消除0.99 mol/L尿素对PCR的抑制作用。300 mmol/L BSA、6.5 mmol/L亚精胺、20%PEG6000、50%甘油可消除6.98 mmol/L血红素对PCR的抑制作用。40%甲酰胺、10%NP40、40% Tween-20、1.5 mol/L海藻糖、2%明胶、200 mmol/L TMAC和20% Triton X-100均无法降低6.98 mmol/L胆酸盐、0.99 mol/L尿素和6.98 mmol/L血红素对PCR的抑制作用。见表3。

表3 不同浓度增强剂抗胆酸盐、尿素和血红素抑制作用

3 讨论

理论上，PCR可以检测单个细胞或DNA分子。然而，PCR抑制物的存在影响了PCR的扩增效率，从而降低了PCR的检测能力，降低了检测灵敏度。增强剂是解决PCR抑制问题的有效方法。目前已有多种PCR增强剂被开发出来[5]。

本研究结果显示，亚精胺表现出显著的抗胆酸盐、尿素和血红素抑制的效果。WAN等[6]的研究结果显示，亚精胺对PCR有增强作用，其原理是小分子亚精胺通过促进聚合酶、引物和模板的结合来促进 PCR起始复合物的形成，微摩尔浓度的亚精胺可显著增强植物基因组DNA的扩增。海藻糖、BSA和Tween-20对虾壳成分有抗抑制作用，因此常被用于检测虾样本中病毒的PCR方法中[7]。此外，BSA可以提高rTth酶对生物样本的抗性，且BSA中的赖氨酸含量高，可结合核酸提取过程中残留的酚类化合物，保护TaqDNA聚合酶活性，从而起到增强PCR扩增效率的作用[8]。甜菜碱具有破坏富含GC的DNA序列的能力，可提高PCR扩增的产量和特异性。在中药材鉴定中，硫酸铵可以优化引物与模板的特异性结合，提高PCR的特异性。本研究结果显示，硫酸铵具有显著的抗尿素抑制作用。有研究结果显示，PEG600和甘油可通过增强酶的热稳定性及保护酶活性来提高PCR产物的产量[9]。本研究结果显示，甘油和PEG6000对不同抑制物表现出了不同的增强作用，甘油对胆酸盐有显著的抗抑制作用，而PEG6000对尿素和血红素有显著的抗抑制作用，这可能与抑制物自身的性质有关，不同抑制物抑制PCR的机制有一定差异。

综上所述，本研究所选的3种抑制物（胆酸盐、尿素和血红素）在临床检测中较为常见，即使样本经过某些前处理，仍不可避免地会有抑制物残留。通过对PCR增强剂的筛选，可以为PCR抑制问题提供一个可行的研究方向和解决方法，提高荧光PCR的检测灵敏度。