李会贤 冯 博 黄柳娟 邵 毅,* 张东来,*

(1 上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海 201403；2 上海海洋大学食品学院，上海 201306)

抗生素的过量使用会导致耐药菌和耐药基因迅速增殖[1]。而且即便没有使用抗生素，食源性耐药菌也会通过耐药基因的迁移而影响人类共生菌的耐药性[2-3]，严重威胁人类健康。即食熟肉制品中存在抗生素耐药菌污染[4]，但其污染途径尚不明确，而且加工方式是否会影响食品中耐药菌的数量和种属、不同熟食基质上的耐药菌向消费者扩散耐药基因的风险大小等问题尚待揭示。

食品中的致病菌或条件性致病菌对人类具有直接危害，因而备受关注，即食食品的耐药菌研究也大多以致病菌为研究对象[5-6]。然而，越来越多的证据表明，数量庞大且遗传背景多样的非致病菌是耐药基因的存储库，可成为耐药基因发生水平迁移的供体、受体和中间载体[7]。因此，在整个细菌范围内研究抗生素耐药菌的污染状况及耐药性的迁移风险，更能反映即食食品中抗生素耐药菌的整体污染水平和潜在风险。与大多数熟肉制品相比，白斩鸡加工温度低、时间短，因此具有特殊的菌群结构[8]，但其耐药细菌的污染特征和迁移风险还鲜有研究报道。

本研究以市售散装白斩鸡为研究对象，分析其四环素耐药菌(tetracycline resistant bacteria, TETr)和四环素耐药基因的污染水平，并用非选择性培养基随机分离获得四环素耐药细菌，鉴定其种属，探讨其污染来源，最后基于自然转化技术探究耐药菌株向异种细菌传播耐药基因的频率，以期丰富白斩鸡表面细菌的耐药数据库，为散装白斩鸡的微生物风险控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从上海4个区(浦东新区、奉贤区、徐汇区、闵行区)的25个熟食店中收集白斩鸡样品25份。为模拟消费者食用鸡肉熟食的储存习惯，采样后将样品置于装有冰袋的保温箱并于12 h内运回实验室进行四环素耐药菌的计数和分离。为避免采样及贮运过程的交叉污染，戴一次性无菌手套进行样品收集，直至实验室取样前，白斩鸡样品全程置于无菌袋中并封口。

脑心浸液肉汤(brain heat infusion，BHI)琼脂培养基、琼脂、水解酪蛋白培养基(mueller-hinton agar，MHA)，环丙沙星(ciprofloxacine，CIP)药敏实验纸片、头孢噻肟(cefotaxime，CTX)药敏实验纸片、强力霉素(doxycycline，DOX)药敏实验纸片、红霉素(erythromycin，ERM)药敏实验纸片、四环素(tetracycline，TET)药敏实验纸片、磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole，SUL)药敏实验纸片，英国OXOID公司；CIP、CTX、DOX、ERM、SUL、三甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim，TRI),美国Sigma公司；TET，美国Diamond公司；真菌抑制剂放线菌酮(cycloheximide，CYC)，美国Amresco公司；荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR，Q-PCR)试剂，北京全式金生物技术有限公司；PCR引物，生工生物工程(上海)股份有限公司；混合纤维滤膜，上海上药新亚药业有限公司。大肠杆菌J53由华南理工大学闫鹤副研究员惠赠。

1.2 仪器与设备

1300 SERIES A2生物安全柜，美国Thermo Fisher Scientific公司；Medcenter Einrichtungen GmbH恒温培养箱，德国Friocell公司；LighTCycler 96荧光定量PCR 仪，德国Roche公司；Minibeadbeater 24研磨珠均质机，美国OMNI公司；Sub Cell GT System电泳仪,GelDoc XP+Imager凝胶成像分析系统，美国Bio-Rad公司。

1.3 试验方法

1.3.1 四环素耐药菌的菌落计数 在无菌条件下剪取25 g样品于均质袋中，加入225 mL无菌生理盐水，在匀浆机下拍打2 min[9]，10倍梯度稀释后，每个梯度吸取200 μL稀释液分别涂布于含有16 μg·mL-1TET[10]和100 μg·mL-1CYC，或仅含有100 μg·mL-1CYC的BHI琼脂培养基平板上，于36℃培养36 h，每个梯度做2个平行。分别进行四环素耐药菌和可培养细菌总数的菌落计数。

1.3.2 耐药基因的定量分析 根据Gao等[11]的方法，用SYBR Green荧光定量PCR(qRT-PCR)法对先采集的13个白斩鸡样品中的6个四环素类耐药基因tetA、tetB、tetC、tetD、tetJ、tetM和一类整合酶基因intⅠ及16SrDNA基因进行定量分析，获得各基因的拷贝数后，计算各基因与16SrDNA拷贝数相比的相对拷贝数。qRT-PCR中使用的重组质粒由上海农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所生物实验室构建，qRT-PCR引物见表1。

表1 四环素耐药基因、int I基因及16S rDNA基因引物对Table 1 Primers of tetracycline resistance genes, int I gene and 16S rDNA gene

1.3.3 四环素耐药菌的分离鉴定及多耐表型分析 为减少耐药细菌分离株的假阳性率，将菌落分离BHI培养基中的四环素含量提高至计数培养基时的3倍，即48 μg·mL-1，按1.3.1的步骤进行样品稀释、涂布和培养，挑取形态不同的单菌落，PCR扩增其16SrDNA基因后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，并用NCBI blast进行菌种鉴定。随后用试纸片扩散法[12]分析分离获得的四环素耐药菌对抗生素CIP、CTX、DOX、TET、ERM、SUL/TRI的药敏性。

1.3.4 耐药基因的接合转移 将分离自白斩鸡表面的耐药细菌单菌落于37℃、200 r·min-1摇床中培养8～12 h至菌液在600 nm处的光密度值达到1.5～1.7，用灭菌牙签点接种至含有128 μg·mL-1NaN3的BHI琼脂培养基上，若未增殖，则判定该菌株对128 μg·mL-1NaN3敏感，反之则耐受[13]。选取对NaN3敏感且对TET耐药的菌株作为耐药基因的供体菌，及对CIP、CTX、DOX、TET、SUL/TRI均敏感但对NaN3耐药的受体菌大肠杆菌J53作为受体菌，用膜过滤转化法[14]进行接合转移试验：将活化的供体菌和受体菌按1∶2的比例混合，并将100 μL混合液转移至放有纤维素混合膜的BHI琼脂培养基上，静置10～15 min后，待其完全吸收于37℃培养18～24 h；将滤膜上的细菌刮至BHI液体培养基中并进行梯度稀释，吸取各梯度细菌悬液200 μL于含有128 μg·mL-1NaN3+ 32 μg·mL-1TET、或不含有抗生素和NaN3的BHI琼脂培养基上，均匀涂布后，于37℃培养18～24 h后查看双抗平板上是否有接合子，并按以下公式计算接合转移率：

接合转移率=接合子菌落数/总菌落数×100%。

1.3.5 数据分析及制图软件 数据分析和制图均采用Excel 2010完成。

2 结果与分析

2.1 市售白斩鸡产品中四环素耐药细菌的污染水平

由图1可知，25个白斩鸡熟食样品中均分离到TETr菌，菌落数为(7.07×101～1.67×108)CFU·g-1，占总可培养细菌总数的1.01%～100%；80%(20/25)样品中TETr菌计数超过105CFU·g-1，其中1个样品(19号)中TETr菌甚至达到108CFU·g-1。因此，本试验验涉及的白斩鸡样品中普遍存在四环素类耐药菌污染。

分子水平证据进一步证明市售白斩鸡产品表面存在大量的四环素耐药菌。13个白斩鸡样品的qRT-PCR结果表明，所有样品均检出tetA、tetB和tetM3种四环素耐药基因，tetC和tetD的检出率均为76.92%(10/13)，tetJ的检出率为84.62%(11/13)；tetA含量最高，在4个样品中相对拷贝水平超过10-2(即1%)，且最高可达2.4×10-1(图2)。此外，所有样品中均存在intⅠ基因，其相对拷贝数在5.31×10-6～3.73×10-1之间。已有证据[15-16]表明，一类整合子在细菌多重耐药的发生和迁移中起到了关键作用。本研究检出较高拷贝数的intⅠ 基因，预示耐药基因可能发生水平迁移。

图1 市售白斩鸡产品中可培养细菌总数和四环素耐药菌计数Fig.1 Prevalence of total cultivable bacteriAAnd TETr bacteria in retail soft-boiled chicken samples

2.2 市售白斩鸡表面耐药细菌的鉴定及多重耐药表型分析

本研究共分离获得13株TETr菌，包括芽孢杆菌属(Bacillus)细菌4株，莫拉氏菌属(Moraxella)细菌3株，嗜水气单胞菌属(Aeromonas)细菌2株，以及肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、不动杆菌属(Acinetobacter)、乳酸乳球菌亚种(Lactococcuslactissubsp.)和希瓦氏菌属(Shewanella)细菌各1株。所有菌株均至少对2种抗生素耐药，其中5株(表2，序号1、2、3、7和13)具有三重耐药性。

2.3 市售白斩鸡表面耐药基因的迁移风险

7株对NaN3敏感的耐药基因供体菌在接合转化试验后，有3株接合子获得四环素耐药表型，接合转移率分别约为10-6或10-2(表3)。发生耐药基因的接合转移的供体菌为2株莫拉氏菌和1株不动杆菌。两株莫拉氏菌的抗生素药敏性表型一致，但与受体菌的接合频率差异巨大，可能因为耐药基因携带质粒的迁移机制不同。

表2 市售白斩鸡产品中耐药菌种与药敏性Table 2 Antibiotic-resistant strains and antibiotic sensitivity of retail soft-boiled chicken samples

表3 耐药基因供体菌和受体菌的接合转化结果Table 3 Junction transformation of donor and recipient bacteria

图2 市售白斩鸡产品中耐药基因相对拷贝量Fig.2 Relative copies of resistance genes in retail soft-boiled chicken samples

3 讨论

本研究结果表明，市售散装白斩鸡存在四环素耐药菌污染风险，其中1个样品的TETr菌甚至达到了108CFU·g-1，远高于烹饪完成初期的白斩鸡[17]，或具有包装的其他类别的即食鸡肉产品中的细菌污染水平[18]，与Wang等[19]关于美国市售火鸡熟食的TETr菌高达107CFU·g-1的报道相近。四环素耐药基因及一类整合子基因的qRT-PCR分析结果进一步证实了白斩鸡产品表面四环素耐药菌污染的普遍性和耐药基因的水平迁移潜势。

已有报道表明，白斩鸡表面相对丰度较高的细菌种属有不动杆菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属、乳球菌属[8]。本研究暂未分离到耐四环素的假单胞菌属细菌，但其他3种菌属的四环素耐药菌均有检出，说明白斩鸡表面的优势菌属很可能已具有耐药性。本研究分离获得的4种四环素耐药菌(芽孢杆菌、气单胞菌、不动杆菌和希瓦氏菌)曾在生鲜鸡肉[20]和鸡的肠道[21]中鉴定出，但对四环素耐药的鸡源莫拉氏菌属、肺炎链球菌和乳酸乳球菌鲜有报道，因此推测加工过程的二次污染可能是市售白斩鸡表面耐药菌的来源之一。

本研究中鉴定到的四环素耐药菌属中，芽孢杆菌能产生极具耐受性的孢子，部分菌种(如蜡样芽孢杆菌属Bacilluscereus)对人体具有致病性，且已有研究证实芽孢杆菌可成为携带耐药基因质粒的寄主，参与四环素耐药基因的水平迁移[22]，因此有必要进一步确认本研究中分离的芽孢杆菌菌种及其耐药迁移风险。气单胞菌是常见的人畜鱼共患病原菌，可在很大程度上促进抗生素耐药性的传播[23]。不动杆菌属细菌是冷鲜鸡肉微生物菌群中的优势菌属[24]，且在高盐的鸡肉调理品中仍存在[25]，说明其在鸡肉加工过程中具有较强的耐环境胁迫能力；此外，作为一种条件性致病菌，近些年不动杆菌属细菌的临床多重耐药性越来越普遍[26]，因此其在食品中的耐药性值得关注。乳酸乳球菌能产生多药转运蛋白，介导其对多种临床抗生素产生耐药性[27]，近年来科研人员还在乳酸乳球菌中发现了具有高频接合能力的pAMβ1质粒，其介导的广寄主的耐药基因转移效率是不含该质粒时的10 000倍[28]。综上，上海市售白斩鸡表面的几种四环素耐药细菌在理论上可能存在耐药基因的迁移风险。

现有对四环素耐药基因在食品微生物中的水平迁移研究表明，四环素耐药基因可通过质粒和转座子在菌群间迁移，如奶酪源四环素耐药肠球菌和乳杆菌向变形链球菌自然转移四环素耐药性的接合率约为10-9～10-8，电转化效率约为10-8[3]；鲜肉源单增李斯特菌向猪链球菌红霉素耐药株迁移tetM基因的接合转移率约为10-7[29]；发酵香肠中tetK引起的四环素耐药性在木糖葡萄球菌间的迁移率约为10-9～10-7[30]。本研究中1株莫拉氏菌和1株不动杆菌向大肠杆菌J53迁移四环素耐药性的接合转接率高达10-2，其移动原件的结构、迁移机制及四环素耐药性供体菌的特性值得深入研究。

熟食制品表面的致病菌和非致病菌均可能作为耐药基因供体，向异种细菌水平迁移耐药基因[3-4]，肠球菌属、乳酸菌属、肉杆菌属、乳球菌属频繁参与了耐药基因的水平迁移[31-32]。本研究首次证实市售散装白斩鸡表面的莫拉氏菌属和不动杆菌属细菌在实验室条件下可作为耐药基因的供体，将耐药基因水平迁移至异种细菌。这两种菌的耐药基因迁移机制和相关迁移元件需要进一步研究。

4 结论

本研究结果表明，市售散装白斩鸡表面普遍存在四环素耐药菌污染风险，加工过程中的二次污染可能是污染来源之一。从白斩鸡表面分离到的2株莫拉氏菌和1株不动杆菌可将四环素耐药表型转移至大肠杆菌J53，目前尚未见这两个属的细菌参与耐药基因水平迁移的报道，其耐药基因水平迁移的机制需进一步探索。市售散装白斩鸡表面的四环素耐药菌污染可能增加消费者对食源性耐药菌的暴露风险，应加强白斩鸡加工和销售过程中耐药菌的监测，为食源性耐药菌的风险评估提供依据。