邓丽娜 张疏璇 郑清 张楷歆

摘 要：采用乙醇提取法对菱角壳中黄酮类化合物进行提取，以黄酮类化合物提取率作为指标，经正交实验获得菱角壳中黄酮类化合物提取的最佳工艺。结果表明，乙醇体积分数65%，液料比1∶20，提取温度70℃，提取时间85min时，提取率为3.78%。抑菌试验发现菱角壳中黄酮类化合物提取物对尖孢镰刀菌、禾谷镰孢菌、灰葡萄孢菌病原菌的菌丝生长均有抑制效果，对灰葡萄孢菌、尖孢镰刀菌、禾谷镰孢菌菌丝生长的抑制率分别达到29.41%、23.52%、29.41%。

关键词：菱角壳;黄酮类化合物;抑菌活性

中图分类号 R284.2 文献标识码 B 文章编号 1007-7731（2022）03-0108-04

Abstract： The flavonoids in Trapa bispinosa Roxb. shell were extracted by ethanol. The flavonoid content was used as the index to obtain the optimum extraction technology of flavonoids in Trapa bispinosa Roxb. shell. The results of orthogonal experiment showed that the extraction rate of total flavonoids reached 3.78% when the concentration of ethanol was 65%， the ratio of material to liquid was 1：20， extraction conditions was 70℃ and the extraction time was 85 min. Through antifungal test， it was found that the flavonoids in Trapa bispinosa Roxb. shell had inhibitory effect on hyphal growth of Botrytis cinerea， Fusarium graminearum， Fusarium oxysporum. It was found that the inhibition rate of hyphal growth of Botrytis cinerea， Fusarium oxysporum and Fusarium graminis reached 29.41%， 23.52% and 29.41%， respectively.

Key words： Trapa bispinosa Roxb.shell; Flavonoids; Antifungal activity

1 引言

菱角（Trapa bispinosa Roxb）為一年生草本水生植物，又名腰菱，菱实，水栗[1]。菱角皮脆肉美且含有丰富的营养成分，但是食用果实后剩余的菱角壳被大量丢弃，对环境造成了一定的负面影响[2]。据报道，目前研究者已从菱角壳中提取出多种天然活性成分，有甾醇类、黄酮类、生物碱类、多糖类等，研究证实它们均具有一定的药理作用[3-6]。现对菱角壳的研究多为其活性成分提取以及药理作用方面的研究，而对其在抑菌方面的研究相对较少。

植物病害是造成农业生产作物损失的重要原因之一，而真菌是引起各类植物病害的重要病原物之一。目前为了提高作物生产力和质量，农业生产依然无法摆脱对化肥和农药的依赖。近年来的研究表明，天然黄酮类物质能提高植物对病毒、真菌、细菌、线虫等抗性[7-8]。随着人们环保意识和食品安全意识的提升，人们对安全、有效的农药替代品需求日益增加，而植物源抑菌农药已经成为目前的研究热点[7]。本实验拟以菱角壳为材料，通过单因素和正交试验对菱角壳中黄酮类化合物的提取工艺进行优化，并研究黄酮类化合物提取物对几种植物病原菌的抗菌活性，为菱角壳资源的合理利用提供理论依据，同时为发现植物源杀菌剂提供线索，以期对有害生物的防治发挥重要作用。

2 材料与方法

2.1 试验材料 菱角，采自盐城市董大水生蔬菜专业合作社。芦丁标准品，亚硝酸钠，硝酸铝，无水乙醇，氢氧化钠，土豆，葡萄糖，纯化琼脂，灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum），尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）等。粉碎机，干燥箱，旋转蒸发仪，可见分光光度计，水浴加热锅、超声破碎仪、高压蒸汽灭菌锅、电热炉、移液枪、菌片打孔器等。

2.2 试验方法

2.2.1 样品的制备 取一定量的菱角壳，放入60℃电热鼓风干燥箱中烘干至恒重，用万能粉碎机粉碎后过50目筛，将菱角壳粉分别装入干燥器保存备用。

2.2.2 标准曲线的制定 采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法[9]，按照上海源叶生物有限公司提供的芦丁标准品制备标准曲线，准确称取37.5mg芦丁标准品于30mL容量瓶中，用无水乙醇定容。分别吸取该芦丁标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0置于25mL的容量瓶中，各容量瓶中加入乙醇至12.5mL，再分别加入5%NaNO2水溶液0.7mL，摇匀后静置5min;加入10%Al（NO3）3溶液0.7mL，摇匀，静置6min;再分别加入lmol/L NaOH水溶液5mL，加入无水乙醇至25mL，静置10min后于可见分光光度计510nm处测量吸光度。得到芦丁标准曲线为：Y=0.8664X+0.0036（R2=0.99），芦丁在0.05～0.35mg/mL范围内线性关系良好。

2.2.3 测定指标 采用传统的乙醇提取法提取菱角壳中黄酮类化合物[9]，通过单因素试验初步确定料液比、提取温度、提取时间、乙醇体积分数4因素水平。代入标准曲线方程计算菱角壳中黄酮类化合物的浓度，根据公式（1）计算样品中黄酮类化合物提取率[9]。

样品中黄酮类化合物提取率%=C×V/W×103×100 （1）

其中C：黄酮类化合物浓度，mg/mL;V：样液总体积，mL;W：菱角壳粉的质量，g。

依据单因素试验结果，分别选择料液比（A）、乙醇体积分数（B）、提取温度（C）、提取时间（D）这4个因素，设计适宜范围内的3个不同水平，如表1所示L9（34）进行正交实验。

2.2.4 抑菌试验 抑菌活性测定采用抑制菌丝生长速率法[10]，取黄酮类化合物提取液1mL涂布于PDA培养基上，以无菌水涂布为空白对照，分别接种3mm的灰葡萄孢菌、禾谷镰孢菌、尖孢镰孢菌的菌片进行培养，将各平板倒置放入26～28℃恒温培养箱中观察其生长情况。根据公式（2）、（3）测定抑菌活性。

病原菌菌落直径=测量直径平均值-3mm （2）

抑菌率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照组菌落直径×100 （3）

3 结果与分析

3.1 单因素试验

3.1.1 料液比对菱角壳黄酮类化合物提取率的影响 由图1可知，料液比在1∶15～1∶25（g：mL）的范围时，黄酮类化合物提取率逐渐增加;当料液比达到1∶25（g：mL）时，黄酮类化合物提取率达到2.71%，当料液比继续增大时，黄酮类化合物提取率趋于稳定，分析原因可能是当物料比达到1∶25时，黄酮类化合物已经基本溶出，达到最大溶解量。由此选取最佳料液比为1∶25（g：mL）。

3.1.2 乙醇提取分数比对菱角壳黄酮类化合物提取率的影响 由图2可知，随着乙醇体积分数的增加，黄酮类化合物提取率先增高后降低;当乙醇体积分数为70%时，黄酮类化合物的提取率达到3.33%;随着乙醇体积分数继续增加，黄酮提取率反而降低。分析可能是部分黄酮类化合物是水溶性的，过高浓度的乙醇影响水溶性黄酮类化合物的溶解。因此选取最佳乙醇体积分数为70%。

3.1.3 提取温度比对菱角壳黄酮类化合物提取率的影响 由图3可知，随着提取温度的升高，黄酮类化合物粗提物的提取率呈现出先增加后降低的趋势;当提取温度达到75℃时，黄酮类化合物提取率达到3.20%;随着提取温度继续升高，黄酮类化合物提取率出现了降低的趋势，原因可能是当温度过高易破坏了一些黄酮类化合物的结构，从而导致菱角壳的黄酮类化合物提取率降低。因此选取最佳提取温度为75℃。

3.1.4 提取时间比对菱角壳黄酮类化合物提取率的影响 由图4可知，在70～80min范围内随着提取时间的增加，黄酮类化合物的提取率提高，提取时间为80min时提取率达到2.54%;当提取时间继续增加时，黄酮提取率出现下降趋势。其原因可能是随着提取时间延长，黄酮的稳定性降低，杂质易析出，导致提取率降低。因此选取最佳提取时间为80min。

3.2 正交试验 通过正交试验分析可知（表2），各因素对菱角壳黄酮类化合物提取率的影响大小依次为乙醇体积分数（B）>液料比（A）>提取温度（C）>提取时间（D）。最优提取条件为B1A2C1D3，即提取条件为乙醇体积分数65%，液料比1∶20，提取温度70℃，提取时间85min时，黄酮类化合物的提取率最高。为进一步考察上述优选工艺的稳定性，采用上述的最佳提取条件，取3份质量为5.000g的菱角壳粉样品，进行乙醇提取法并计算黄酮类化合物提取率。得到总黄酮的平均提取率为3.78%。

3.3 抑菌试验结果 以无菌水涂布为空白对照，发现菱角壳提取的黄酮类化合物对灰葡萄孢、禾谷镰孢菌和尖孢镰刀菌的菌丝生长均表现出不同程度的抑制（表3）。当空白对照组的3种菌落的菌丝长满平板时，观察可发现菱角壳中黄酮类化合物提取物对灰葡萄孢菌和尖孢镰刀菌抑制效果较好（图3-5）。由菌丝生长抑制率测定值可知，菱角壳提取出的黄酮类化合物对灰葡萄孢菌和尖孢镰刀菌抑制率均达到29.41%，对禾谷镰孢菌抑制率为23.52%。

4 结论

以菱角壳黄酮类化合物的提取率为考察指标，优化最佳的提取工艺参数为：乙醇体积分数65%，液料比1∶20，提取温度70℃，提取时间85min，得到黄酮类化合物的提取率为3.78%。已有文献表明菱角壳的提取物具有一定的抑菌活性[11-12]，而本试验进一步证实菱角壳的黄酮类化合物对3种植物病原真菌有一定的抑制效果，对灰葡萄孢菌和尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制率均达到29.41%，而其中的抑菌活性成分的分离纯化、田间药效、作用机理等尚待深入探讨。本研究结果表明，菱角壳中黄酮类化合物物质是潜在的天然植物抑菌剂，可为植物病原菌抑菌剂的研发提供理论依据，对生物防治起到推进作用。

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（责编：王慧晴）

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