陈镜如，边鑫,杨杨,邢童林，王子轩，任丽琨，胡良术，何林阳，张娜

(哈尔滨商业大学 食品工程学院，黑龙江省谷物食品与综合加工重点实验室，黑龙江省普通高校食品科学与工程重点实验室，哈尔滨 150076)

发酵是一种用于改善食品品质和长期保存食品的加工手段[1]。传统发酵食品通常凭借自然野生菌落发酵为主要生产方式。在进行发酵时通常会引入来自于原料和环境的多种微生物，而这些微生物可利用原料中的营养成分通过三大代谢途径——糖、脂肪和蛋白质代谢改变食物本身的质地及食用品质，产生独特的发酵香气[2]。在我国几千年的历史进程中，开发了原料多样、工艺复杂、种类繁多的传统发酵食品如发酵酒、酸菜、大酱、腊肉等，构成了我国饮食文化重要的组成部分。由于在自然发酵的过程中微生物种类和丰度存在差异，而且常伴有有害菌或致病菌的引入，这会严重影响传统发酵食品的感官品质、风味和食用安全性[3]。因此，揭示传统发酵食品的微生物多样性，探究菌群结构和发酵过程中的核心微生物对科学安全地制作、调控发酵食品有着重要的指导作用，为传统食品的发酵过程工业化、规模化、稳定安全化提供了理论基础。本文重点综述了现代高通量检测方法，对中国传统发酵食品中微生物特殊的多样性结构和主要核心作用微生物、中国传统发酵食品的前景导向进行了展望，为传统发酵食品的加工工艺改良和品质调控提供了理论基础。

1 中国传统发酵食品微生物多样性研究方法

由于传统发酵食品生产方式所涉及到的微生物来源广、种类多、演替演化规律复杂，仅单纯依靠传统人工分离方法不能满足当下人们对传统发酵食品中复杂微生物系统的了解。近些年，随着分子生物技术的不断发展，新一代测序技术正逐渐取代传统培养方法，广泛应用于微生物多样性的分析。这些新一代测序技术一类是扩增子测序，例如一代测序：变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)；二代高通量测序：16S rDNA、ITS测序等;三代测序：16S rDNA全长、宏基因组技术，其优势在于可以对每一条独立的DNA分子进行测序，从而分析得到微生物的物种注释及代谢通路信息。这些技术在发酵酒肉制品、谷物食品等鉴定中都有广泛的应用[4]。

1.1 PCR-DGGE技术

传统的平板分离培养方法过度依赖人工的操作及菌体的生长，实验周期长，不确定性大。PCR-DGGE技术避开了传统检测方法的弊端，采用特异性PCR扩增从样本中提取出来的基因组DNA，在DGGE技术有效分离和快速鉴定后将扩增产物进行分析从而获取到样品中菌群图谱[5]。燕平梅等利用PCR-DGGE技术在不同品种酸菜样品中检测到8种微生物，而散装酸菜的微生物多样性更为丰富，同时，在经16S rDNA测定后，发现乳酸菌属为酸菜中的核心微生物[6]。与传统的测序方法对比，PCR-DGGE技术在对传统方法未能培养出来的菌株进行鉴定时，用时更短，准确度更高，并可对大量样本同时进行测序工作，是研究发酵食品微生物群落结构最常用的分子生物技术之一[7]。但该技术具有一定的局限性，当对复杂的生态系统进行研究时，对丰度较低(低于1%)的微生物无法检测出来[8]。

1.2 高通量测序技术

高通量测序技术是基于高通量测序平台检测特定环境下的微生物，并结合生物与信息学来分析样本中各种微生物物种种类、物种丰度、种群结构、系统演变等相关信息。根据细菌和真菌间的序列差异，高通量测序可以化分为16S rDNA、18S rDNA和ITS测序。16S rDNA主要进行原核微生物的物种鉴定，而18S rDNA和ITS测序主要用于真核微生物的鉴定。不同测定方法的检测区域及主要目的见表1[9]。

表1 不同微生物多样性测序方法功能对比

相比PCR-DGGE技术，高通量测序通过获得大量测序结果数据，能够对丰度低于0.0001%的痕量菌准确检出，从而系统完整地解析样品中微生物菌相组成。李欣蔚等通过16S rDNA测序技术对自然发酵酸菜样品中的多样性组成进行了分析，与PCR-DGGE技术测定结果相吻合，证实了高通量测序的准确性[10]。在真菌鉴定方面主要有ITS测序技术和18S rDNA技术两种，18S rDNA虽然能有效地鉴定出真核微生物的存在并进行物种注释，但其准确度往往较低，在实际测序中常有部分真菌不能被分类。ITS测序技术较18S rDNA技术测序的准确度更高，对真菌微生物的鉴定能力更强。然而，高通量测序技术由于针对局部DNA区域的鉴定，因此，只能完成微生物属水平鉴定。随着三代测序的蓬勃发展，全长高通量序列测定可以弥补微生物在种水平鉴定上的空白。曹碧璇等利用16S rDNA基因全长序列分析鉴定出自然发酵酸菜液样品中有7个细菌菌属及9个菌种，实现了微生物多样性在种水平上的解析[11]。高通量测序是对传统测序的革新式改变，也是目前最常见的测序方法，成本低廉，且令对发酵食品全部基因的深入分析成为可能。

1.3 宏基因组技术

高通量测序技术促进了组学技术的发展，相较于高通量测序，宏基因组基于对现代基因组学技术的应用，其优势在于不仅可以准确地对样品进行物种注释，而且可以进行功能注释，挖掘部分微生物的功能基因对其代谢途径进行预测，这为开发利用未知或未被培养的微生物、全面探究微生物基因功能性提供了研究基础[12]。彭明芳等利用基因组技术对广西酸菜进行功能注释，结果共注释到17种在碳水化合物和氨基酸代谢与转运功能上丰富的基因，如纤维素酶、果胶酶、淀粉水解酶和酯酶等，预测了微生物在酸菜发酵过程中可能发挥的作用[13]。Guo等利用宏基因组技术在白酒窖泥中发现了乳酸菌、芽孢杆菌和梭菌等细菌与乳酸、乙酸等有机酸及乙醇、酯类等风味化合物产生有关，而半乳酵母、青霉菌和曲霉菌等真菌微生物在白酒发酵中可以产生葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶，这对糖酵解过程影响显著并可将淀粉等大分子物质降解为小分子糖[14]，但宏基因组测序对数据处理核心技术的要求极高，当样本数量极大时，需要进行多次测序，且宏基因组测序方法的定义和算法还不完善，是目前微生物学家面临的一大难题。

目前对于研究发酵食品常用的测序方法如上所述，不同的方法各有特点，比如PCR-DGGE技术的高效快速，高通量测序技术的精准分析，基因组技术的功能基因注释。在实际的应用选择中，要结合样品的状态、测序的目的、预期的深度以及性价比进行合理选择。

2 传统发酵食品微生物多样性及核心微生物研究进展

近些年来，学者们对传统发酵食品的微生物多样性展开了研究，产品主要涉及7大类，分别为发酵谷物类、豆类、乳类、蔬菜类、肉类、酸面团类和其他。每一类都包含许多具有代表性的发酵食品，具体产品分类见表2。本部分内容针对上述类别的中国传统发酵食品中微生物多样性研究进行了综述。

表2 中国传统发酵食品分类及代表产地

2.1 传统发酵乳制品

中国传统发酵乳制品主要分为两类，分别是酸奶和奶酪，在新疆、内蒙古、西藏等地有着深远的制作历史。这些发酵乳制品的品质往往因为地理环境因素以及人为因素而呈现出微生物菌群组成上的差异，见表3。中国传统发酵乳制品的微生物组成复杂多样，不同地域的微生物组成各有特点，通过对传统发酵乳制品微生物多样性的解析，不仅可以更好地对其品质进行调控还对乳制品同质化以及有效溯源体制的建立有着重要的指导意义。

表3 不同产地发酵乳样品微生物多样性组成对比Table 3 The comparison of microbial diversity composition of fermented milk samples from different producing areas

2.2 传统发酵谷物制品

2.2.1 发酵酒类制品

我国的酒文化历史深远，酿酒工艺传承了几千年，其中在酿酒过程中，发酵是一个关键的环节。中国发酵酒要经过独特而复杂的系统发酵，由于原料不同，酒曲不同及发酵工艺不同等，衍生出不同种类的发酵酒，其中最具代表性的是白酒、黄酒及米酒。大量研究发现不同酒曲的微生物菌群结构差异较大，赋予了白酒和黄酒不同种香型，如清爽型、凤香型、浓香型、芝麻香型等，见表4。

表4 不同香型发酵酒类微生物多样性

此外，学者们还对部分酒曲的白酒以及不同原料的黄酒和米酒中的微生物多样性进行了分析，其他酒曲的白酒及不同原料的黄酒和米酒中微生物种类和核心微生物的情况见表5。运用测序技术对发酵酒微生物群落结构进行解析可以更好地区分不同种类的酒以及工业化大规模生产酒。

表5 不同酒曲及原料发酵酒类微生物多样性[24-30]Table 5 The microbial diversity of fermented wines with different kojis and raw materials

续 表

2.2.2 发酵醋制品

食醋在我们日常进行食物加工过程中是必备的酸性调味品之一。中国传统醋的生产有固态、液态及静态表面发酵之分。液态发酵具有更高的醋酸产量、更短的发酵时间和更低的成本，而固态发酵酿造的醋具有独特的风味和口感。其中差异来自于不同发酵方式下微生物菌群结构与演替规律的差异。Jiang等对液态发酵制成的红曲醋的微生物多样性进行了测定，共鉴定出10个细菌属和13个真菌属，其中乙酰耐受乳杆菌为红曲霉醋的优势细菌属，嗜盐梗孢酵母为优势真菌属[31]。聂志强等对天津老醋的固态发酵生产过程中发现乳酸菌在整个发酵过程中均处于绝对优势地位，为固态发酵醋的优势细菌属，但随发酵持续进行，醋酸菌属丰度也在逐渐升高，是重要的酸性产物代谢菌[32]。通过发酵醋制品菌群结构的解析及其对产品风味品质的影响分析，可以获得用于发酵醋的优良菌株，实现产品的工业化生产和风味品质的调控。

2.2.3 发酵豆制品

发酵豆制品往往以大豆为原料，在不同制作工序及菌群结构的作用下成为不同的产品。不同发酵豆类制品在原料、发酵时间以及发酵工艺上微生物存在的差异见表6。

表6 不同发酵豆类制品核心微生物及其功能[33-37]Table 6 The core microorganisms in different fermented bean products and their functions

续 表

2.3 传统发酵蔬菜制品

发酵是一种古老而广泛使用的用来保存新鲜蔬菜的加工技术，如东北的酸菜、四川的泡菜和广西的酸笋等。这些发酵蔬菜常因为地理区域与原材料的不同，经不同发酵工艺而有着不同的菌落结构，见表7。乳酸菌在大多数发酵蔬菜制品中广泛存在，并起着关键的代谢作用和重要的功能性，许多研究也证实了乳酸菌在发酵蔬菜过程中产酸，形成醇、酯、醛等基础风味，抑制腐败，延长货架期等[38]。

表7 常见发酵蔬菜优势微生物种类[39-42]Table 7 The dominant microbial species of common fermented vegetables

2.4 传统发酵鱼、肉制品

传统发酵肉制品通常采用较高浓度的盐对原料进行腌制发酵，不同地区的发酵肉制品因原料、产地以及工艺的不同，微生物组成上存在着明显的差异。如浙江金华火腿的核心发酵菌属为乳杆菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属等[43]，而云南宣威火腿多为孢囊放线菌属、乳酸杆菌、棒状杆菌属、小单孢菌属、链霉菌，这些微生物菌群结构上的不同主要来源于样品产地的差别[44]。此外，原料的不同造成了发酵肉制品微生物菌群结构的差异性并发挥着不同的功能，见表8。

表8 不同发酵肉制品主要核心微生物及功能[45-46]Table 8 The main core microorganisms and functions of different fermented meat products

2.5 传统发酵酸面团

中国的传统发酵酸面团制品主要以馒头为主，传统馒头的制作大多以酵子为发酵剂。研究发现，酵子的来源决定了其微生物组成。杨可等发现关中不同地区的馒头酵子中优势菌属均为乳酸菌属，但不同地区的微生物组成差异较大。传统酵子馒头往往风味之间存在差异，这也与酵子中微生物的组成和代谢有着密切联系[47]。Suo等利用高通量测序方法研究了中国传统发酵剂发酵的馒头的微生物多样性及风味成分，结果显示以乳酸杆菌和片球菌为主的优势菌属在呈味方面发挥着重要的作用[48]。马凯等在对传统酵子细菌多样性的研究中进一步确定了乳酸菌中以魏斯氏菌属与乳酸乳杆菌属为主的优势地位，并明确与商业酵母相比，醇类化合物的含量和种类是区分传统酵子发酵馒头与商业酵母的关键[49]。

此外，学者们还对发酵茶如普洱茶、黑茶等[50-51]传统发酵食品中微生物多样性进行了研究，为提高产品加工效益和食用品质提供了理论参考。

3 展望

中国传统发酵食品种类多，微生物多样性丰富，大多数仍停留在作坊式、家庭式的制作模式中，只有极少数发酵制品实现了工业化发展。这就使我国传统发酵食品存在工艺缺乏创新、制作周期冗长、安全稳定性较差等原始问题，难以实现传统发酵食品规模化、产业化发展。未来我们不仅需要全面了解传统发酵食品中的菌群结构、关键微生物信息，还需要深入了解发酵过程中与风味或品质有关的功能性微生物的作用，对其发酵机理进行挖掘，获得发酵性能优良的菌种，建立发酵食品菌种保藏库，以期为人为调控中国传统发酵食品的发酵过程，使中国传统发酵食品规模化、产业化、安全化生产。