韩世明，方玉梅，吴莲莲，陆康宁

(六盘水师范学院 生物科学与技术学院，贵州 六盘水 553004)

辣椒红色素是在成熟辣椒中提取的一种天然的红色素[1]。辣椒红色素不仅具有色价较高、着色力强、保色效果好[2]等优点，还具有良好的抗辐射、抗肿瘤等功效[3]，因此，辣椒红色素的使用较为普遍，不仅适用于海鲜、肉类、饮料等食物，同时还可以使仿真食品的货架期大大延长。

从红辣椒中提取辣椒红色素的方法主要有油溶法[4-5]、有机溶剂法[6]、超声波溶剂提取法[7-8]、微波辅助提取法[9]、酶提取法[10]、超临界CO2流体萃取法等[11]。油溶法提取时，红色素与油的分离难度较高，提取速率较低，同时产品的色价不高，现在已经基本没有厂商使用该种方法[12]。用有机溶剂提取后剩余的残渣中辣椒红色素的含量较多，成品中的杂质较多，花费的成本较高，纯化红色素也较为昂贵，残留物的可利用性低，对于工业化生产来说较为困难[13]。超临界CO2流体萃取法获得的成品中色素种类较多，操作相较于其他方法较为简单，而且成品较纯，但由于仪器价格高昂、成本较高，小的生产厂商一般无法承担，因此该方法使用较少。

由于细胞壁的阻拦，辣椒红色素的溶出速率较低，用纤维素酶破坏植物细胞壁可以加快红色素的溶出[14]；超声波的机械作用也可以使内溶物的溶出速度加快[15]。与传统的油溶法、有机溶剂法相比，超声辅酶提取法的提取率高、提取时间短、产品纯度高、操作工艺简单、设备维护和保养方便，是一种实现高效、节能、环保式提取的现代高新技术手段[16]。

本研究对超声辅助酶法提取辣椒红色素的工艺进行优化，在单因素实验(酶浓度、超声功率、超声时间和超声温度)的基础上，通过响应面分析法对实验结果进行分析并进行实验验证，确定最佳的提取工艺，为辣椒的进一步开发与利用提供了参照。

1 材料与方法

1.1 材料

风干铁皮椒：购于市场。

1.2 试剂

无水乙醇、丙酮：国药集团化学试剂有限公司；纤维素酶、果胶酶：南宁庞博生物工程有限公司。

1.3 主要仪器与设备

GZX-9240MBE电热恒温鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；752N紫外可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；ATY-124电子天平 上海西艾爱电子有限公司；DFT-200高速万能粉碎机 温岭市林大机械有限公司；SB-800DT超声波清洗机 浙江宁波新芝生物科技有限公司；SHB-3循环水式真空泵 郑州杜甫仪器厂。

1.4 方法

1.4.1 辅助酶的选择

称取1 g样品，置于25 mL的65%乙醇中，分别加入4 mg纤维素酶、4 mg果胶酶、2 mg纤维素酶+2 mg果胶酶，在超声功率350 W下超声处理65 min，然后抽滤得滤液，将滤液定容至50 mL，在514 nm处[17]测定吸光度。

1.4.2 单因素实验

以吸光度值为指标，采用单因素实验研究酶用量、超声功率、乙醇浓度、超声时间对辣椒红色素提取效果的影响，实验水平分别选取加酶量1，2，3，4，5，6 mg；乙醇浓度45%、55%、65%、75%、85%、95%；超声功率210，280，350，420，490，560 W；超声时间45，55，65，75，85，95 min。对提取条件进行初步优化，确定较佳因素实验参数范围，每个处理重复3 次，结果取平均值。

1.4.3 响应面优化实验

在辣椒红色素提取的单因素实验结果基础上，选择超声功率，乙醇浓度、超声时间、酶用量的4个单因素进行四因素三水平的Box-Benhnken实验设计，然后用Design-Expert 8.0软件进行响应面分析，以此得出提取辣椒红色素的最优条件。

表1 响应面实验因素和水平Table 1 The factors and levels of response surface experiment

1.4.4 辣椒红色素色价的计算

将在最优条件下提取的辣椒红色素的粗提物在60 ℃烘干至恒重，用丙酮溶解后并测定吸光度值，按照以下公式计算辣椒红色素色价：

(1)

2 结果与分析

2.1 辣椒红色素提取的单因素实验结果

2.1.1 辅助酶的选择

图1 不同酶提取辣椒红色素Fig.1 Extraction of red pigment from Capsicum annuum by different enzymes

由图1可知，添加4 mg果胶酶的吸光度值和不加任何辅助酶辣椒红色素的吸光度值相差不大，添加4 mg纤维素酶与添加2 mg纤维素酶+2 mg果胶酶的混合酶辣椒红色素的吸光度值差值不大，在本次单因素实验中，果胶酶的作用相当于没有，所以，在接下来的实验中只添加纤维素酶。

2.1.2 纤维素酶用量对辣椒红色素提取的影响

图2 不同酶用量提取辣椒红色素Fig.2 Extraction of red pigment from Capsicum annuum with different enzyme additive amount

由于细胞壁的阻拦，辣椒红色素的溶出速率较低，用纤维素酶破坏植物细胞壁，改变了细胞结构，提高了辣椒红色素向乙醇扩散的速率，加快了红色素的提取。由图2可知，在控制其他条件不变的情况下，根据酶用量不同提取出的辣椒红色素的吸光度值呈先上升后略微下降的趋势。其原因是：加酶量低于4 mg时，随着酶用量的增加，酶与酶的作用物接触面积在不断增加，辣椒红色素的吸光度值也在增加；在酶用量超过4 mg时，吸光度值下降，有可能是因为底物浓度饱和，再继续添加酶有可能抑制酶的作用。在纤维素酶用量为1～4 mg的范围内，辣椒红色素的吸光度值不断增大，当纤维素酶用量超过4 mg时，其数值开始降低，故选择纤维素酶用量4 mg为本次实验的最佳用量。

2.1.3 乙醇浓度对辣椒红色素提取的影响

图3 不同浓度的乙醇提取辣椒红色素Fig.3 Extraction of red pigment from Capsicum annuum with different concentration of ethanol

由图3可知，当乙醇浓度在45%～75%时，辣椒红色素的吸光度值随着乙醇浓度的增加而增加，但当乙醇浓度超过75%时，辣椒红色素的吸光度值随着乙醇浓度的增加而略有降低。其原因可能是过高浓度的乙醇大大抑制了酶的作用，导致细胞被破坏的程度降低，减少了辣椒红色素的渗出量，导致辣椒红色素的吸光度值降低。由此可见，本次实验乙醇的最佳提取浓度为75%。

2.1.4 超声功率对辣椒红色素提取的影响

图4 不同超声功率提取辣椒红色素Fig.4 Extraction of red pigment from Capsicum annuum with different ultrasonic power

由图4可知，起初辣椒红色素的吸光度值与超声功率成正比，在功率为420 W时，辣椒红色素的吸光度值达到峰值，之后辣椒红色素的吸光度值与超声功率成反比。在峰值之后，辣椒红色素的吸光度值开始下降，原因可能是辣椒红色素的组成被超声波的空化效应破坏。

2.1.5 超声时间对辣椒红色素提取的影响

图5 不同超声时间提取辣椒红色素Fig.5 Extraction of red pigment from Capsicum annuum with different ultrasonic time

由图5可知，起初辣椒红色素的吸光度值与超声时间成正比，当超声时间达到75 min时，辣椒红色素的吸光度值升到顶峰，之后辣椒红色素的吸光度值与超声时间成反比，辣椒红色素的吸光度值开始下降。辣椒红色素在超声波的空化效应等作用下，可以加快其提取速率，但时间过长，辣椒红色素的组成被破坏，使其变成其他物质，这便使得辣椒红色素的吸光度值不断降低。

2.2 响应面法优化实验设计及结果分析

2.2.1 响应面实验设计与分析

结合单因素的实验结果，选择超声功率、乙醇浓度、超声时间和酶用量等因素，以辣椒红色素的吸光度值为响应值，采用Box-Behnken响应面实验设计四因素三水平的实验，响应面实验结果见表2，方差分析见表3。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Response surface test design and results

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

续 表

响应面实验结果见表2，以辣椒红色素的吸光度值为指标，利用软件Design-Expert 8.0对数据进行分析，得到回归方程为：Y=1.12+0.0353A+0.0048B+0.0098C+0.0008D-0.0058AB+0.0023AC+0.0022AD-0.0060BC+0.0027BD+0.0022CD-0.1620A2-0.0801B2-0.0756C2-0.0665D2。

由表3可知，模型的P值<0.0001，表明回归模型极显著，失拟项的P=0.0621>0.05，模型的失拟项不显著，表明本次实验的模型合适，本次实验的实验数据具有意义。

2.2.2 响应面交互作用分析

根据软件得到的响应面曲线图及等高线图见图6～图11，分析超声功率、乙醇浓度、超声时间、酶用量4个因素对辣椒红色素提取的交互作用。

图6 超声功率和乙醇浓度对辣椒红色素提取影响的响应面及等高线图Fig.6 Response surface and contour diagram of the effect of ultrasonic power and ethanol concentration on the extraction of red pigment from Capsicum annuum

由图6可知，等高线接近圆形，表明超声功率和乙醇浓度的交互作用不强，超声功率和乙醇浓度的影响不显著。

图7 超声功率和超声时间对辣椒红色素提取影响的响应面及等高线图Fig.7 Response surface and contour diagram of the effect of ultrasonic power and ultrasonic time on the extraction of red pigment from Capsicum annuum

由图7可知，等高线接近圆形，表明超声功率和超声时间的交互作用不强，超声功率和超声时间对辣椒红色素提取的影响不显著。

图8 超声功率和酶用量对辣椒红色素提取影响的响应面及等高线图Fig.8 Response surface and contour diagram of the effect of ultrasonic power and enzyme additive amount on the extraction of red pigment from Capsicum annuum

由图8可知，等高线为椭圆形，表明超声功率和酶用量的交互作用较强，超声功率对辣椒红色素提取的影响较显著。

图9 乙醇浓度和超声时间对辣椒红色素提取影响的响应面及等高线图Fig.9 Response surface and contour diagram of the effect of ethanol concentration and ultrasonic time on the extraction of red pigment from Capsicum annuum

由图9可知，等高线为椭圆形，表明乙醇浓度和超声时间的交互作用较强，超声时间的影响较显著。

图10 乙醇浓度和酶用量对辣椒红色素提取影响的响应面及等高线图Fig.10 Response surface and contour diagram of the effect of ethanol concentration and enzyme additive amount on the extraction of red pigment from Capsicum annuum

由图10可知，等高线为椭圆形，表明乙醇浓度和酶用量的交互作用较强，酶用量的影响较显著。

图11 超声时间和酶用量对辣椒红色素提取影响的响应面及等高线图Fig.11 Response surface and contour diagram of the effect of ultrasonic time and enzyme additive amount on the extraction of red pigment from Capsicum annuum

由图11可知，等高线为椭圆形，表明超声时间和酶用量的交互作用较强，超声时间对辣椒红色素提取的影响较为显著。

2.2.3 响应面因素水平优化结果及模型验证

用响应面分析回归模型，辣椒红色素的吸光度值预测最大值时各因素水平为超声功率435.250 W、乙醇浓度75.470%、超声时间76.303 min、酶用量4.018 mg，理论上吸光度值为1.125。

为验证响应面法得到的结果的准确性，将最佳提取条件更改为：超声功率434 W、乙醇浓度75.5%、超声时间76.3 min、酶用量4 mg，进行3次重复实验，测得其吸光度值为1.116，可见实际值与理论值相差较小，说明本次实验所建模型与实际情况拟合良好，此次实验所得数据精准可靠，具有一定的实用价值。

2.3 辣椒色价的计算结果

测得的吸光度值为1.237，根据公式计算出辣椒红色素的色价为103.08。

3 结论

通过单因素及响应面实验设计法对超声波辅助酶法提取辣椒红色素的工艺进行优化研究，采用Box-Behnken实验设计和响应面分析法，得到超声波辅助酶法提取辣椒红色素的最佳条件为超声功率434 W、超声时间76.3 min、乙醇浓度75.5%、酶用量4 mg，此条件下，提取出来的辣椒红色素的吸光度最高。同时，本实验建立的回归模型是有效可行的，可以用来预测设定实验因素条件下辣椒红色素提取工艺参数的响应值。该研究结果可为辣椒红色素提取工艺的工业化应用提供参数借鉴。