米智,刘荔贞，武晓红

(1.山西大同大学 生命科学学院，山西 大同 037009；2.山西大同大学化学与化工学院，山西 大同 037009)

高粱(Sorghumbicolor(L.) Moench)是一年生草本植物，禾本科高粱属，具有杂种优势明显、抗逆性强、光合作用效率高、用途广泛等优点[1]。高粱是世界上第五大谷类作物，我国是世界高粱主产国之一，种质资源十分丰富[2]。传统酿酒和制醋工业均采用高粱种仁为原料，故高粱每年种植面积约为133.3万公顷，高粱壳大多成为加工废弃物，进而污染环境，年产量近200万吨[3]。高粱壳颜色多为紫红色(红高粱)和紫黑色(黑高粱)，因其红色素含量较高而成为提取天然色素的重要原料，且具有成本低廉、原料来源稳定等优点[4]。

食用色素分为天然色素和合成色素，合成色素在人体代谢过程中可能产生一定的毒副作用，其发展受到制约；天然色素无毒无害、营养价值高，有些还具有一定的生物活性[5-6]。高粱色素多以高粱红色素为主，高粱黄色素偶尔也有提及[7]。

高粱红色素是用热水或乙醇从黑紫色或红褐色高粱壳中提取的红色色素，主要成分是异黄酮半乳糖苷，是一种天然食用色素，具有生津止渴、消炎解热、扩张血管、降低血糖和血压的作用[8]。因其无毒、无明显异味、价格低廉、染色性能好、色泽自然柔和等优点，已经受到广大学者的普遍关注和青睐[9-11]。根据国家标准GB 2760-2014规定[12]，高粱红色素可用于多种食品的着色[13]。

本文以黑、红高粱壳为研究材料，以酸性乙醇作为提取溶剂，采用响应面方法分析探讨索氏提取法提取高粱红色素的最佳提取条件，为高粱壳提取色素、高粱红色素的下游研究、开发和应用提供了参考。

1 材料和方法

1.1 材料

高粱：山西农业大学/山西省农业科学院提供；高粱红标准品：南京松冠生物科技有限公司；乙醇、盐酸等所有试剂均为分析纯级别。

1.2 仪器与设备

索氏提取器、电子分析天平、数显电热鼓风干燥箱、pH计、数显恒温水浴锅、离心机、高速中药粉粹机、紫外可见分光光度计等。

1.3 方法

1.3.1 高粱处理及高粱红色素提取工艺流程

1.3.1.1 高梁处理

选择籽粒饱满、外观佳的高粱，脱壳后得到颜色较深的红棕色或黑紫色高粱壳，经风选后除掉碎砂石等大颗粒杂质，再用水冲洗掉漂浮物及沉淀下来的高粱粒和细沙土等，晾(烘)干备用。

1.3.1.2 高粱红色素提取工艺流程

高粱壳→粉碎→称重→包装→浸提→定容→离心→测定→计算得率或色价。

1.3.2 高粱红色素色价的计算方法

参照国家标准GB 1886.32-2015《食品添加剂 高粱红》[14]的方法，即：

式中：A为稀释后试样溶液的吸光值；n为稀释倍数；m为高粱壳的质量，g。

1.3.3 高粱红色素提取工艺的单因素试验

1.3.3.1 乙醇浓度

准确称取处理后的高粱壳3 g，在提取时间为2.0 h、提取液pH为3.0、料液比为1∶8(g/mL)时，将乙醇浓度分别设定为55%、60%、65%、70%、75%提取高粱红色素，提取液的吸光值在500 nm处测定。

1.3.3.2 料液比

准确称取3 g处理后的高粱壳，在乙醇浓度为65%、提取液pH为3.0、提取时间为2.0 h的条件下，将料液比设定为1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10(g/mL)提取高粱红色素，并在500 nm处测定提取液的吸光值。

1.3.3.3 提取时间

准确称取3 g处理后的高粱壳，在乙醇浓度为65%、料液比为1∶8(g/mL)、提取液pH为3.0的前提下，设置提取时间为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h提取高粱红色素，并在500 nm处测定提取液的吸光值。

1.3.3.4 提取液pH

准确称取处理后的高粱壳3 g，在乙醇浓度为65%、提取时间为2.0 h、料液比为1∶8(g/mL)的条件下，将提取液pH值设定为2，3，4，5，6提取高粱红色素，并在500 nm处测定提取液的吸光值。

1.3.4 响应面试验设计及统计学处理方法

根据高粱红色素提取工艺的单因素试验结果，从乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)和溶剂pH(D)4个因素中，分别选取对高粱红色素吸光值影响最大的3个水平，采用Design-Expert V8.0.7软件，以500 nm处的吸光值为衡量指标，根据四因素三水平建立响应面试验。采用软件中Box-Behnken中心组合设计原理，确定响应面试验方案，并建立回归方程和预测分析模型，确定高粱红色素的最佳提取工艺参数。

1.3.5 高粱红色素提取工艺的验证性试验

为了证实索氏提取法提取高粱红色素的可靠性和合理性，每个单因素试验结果样品取3份，添加高粱红色素标准品溶液，计算样品的加标回收率。依据响应面试验结果，开展平行验证试验，并计算相对标准偏差(RSD，n=3)。

2 结果与分析

2.1 高粱红色素的提取工艺单因素试验结果分析

2.1.1 不同乙醇浓度对高粱红色素吸光度的影响

图1 乙醇浓度对高粱红色素吸光度的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the absorbance of sorghum red pigment

由图1可知，当乙醇浓度小于65%时，高粱红色素的吸光值随着乙醇浓度的增大而增大；当乙醇浓度为65%时，吸光值达到最大值，约为0.7；当乙醇浓度超过65%时，高粱红色素的吸光值随着乙醇浓度的增大而减小。因此，在响应面试验中，分别选取60%、65%、70%的乙醇浓度作为3个水平。

2.1.2 不同料液比对高粱红色素吸光度的影响

图2 料液比对高粱红色素吸光度的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the absorbance of sorghum red pigment

由图2可知，高粱红色素的吸光值随着料液比的增大而提高，当料液比为1∶8时，吸光值最大，约为0.69，试验结果表明，当继续增大料液比时，高粱红色素的吸光值随着料液比的增大而降低。所以在进行响应面试验时应选择料液比为1∶7、1∶8和1∶9。

2.1.3 不同提取时间对高粱红色素吸光度的影响

图3 提取时间对高粱红色素吸光度的影响Fig.3 Effect of extraction time on the absorbance of sorghum red pigment

由图3可知，提取时间在1.0～2.5 h时，高粱红色素的吸光值随着提取时间的延长而增大，且在2.5 h时，高粱红色素的吸光值最大，约为0.73，仅比2.0 h时0.72略高，因此，在响应面试验中，选取1.5，2.0，2.5 h的提取时间作为3个水平。

2.1.4 不同pH值对高粱红色素吸光值的影响

由图4可知，提取液pH值在2～3时，高粱红色素的吸光值随着pH的提高而增大，并在pH为3时吸光值最大，约为0.66；当pH在3～6时，高粱红色素的吸光值随着pH值的提高反而降低，因此在做响应面试验时，选取pH值为2，3，4。

2.2 回归模型的建立及其分析

响应面试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平的确定Table 1 The determination of factors and levels of response surface test

响应面试验方案与结果见表2。

表2 响应面试验方案与结果Table 2 The scheme and results of response surface test

续 表

建立高粱红色素提取工艺参数的回归模型，得到了评价指标(高粱红色素吸光值)的响应值对自变量A(乙醇浓度)、B(料液比)、C(提取时间)和D(提取液pH)的响应值的二次多项式回归方程：高粱红色素吸光值OD500(Y)=0.81+0.038A+1.667E-003B+0.022C-0.037D-0.015AB-0.018AC+0.037AD-0.02BC+0.02BD+0.023CD-0.094A2-0.049B2-0.069C2-0.13D2。

表3 回归模型方差分析Table 3 The variance analysis of regression model

以高粱红色素吸光度的OD500 nm值为评价指标，对模型进行方差和显著性分析检验(见表3)，回归模型具有统计学意义(P<0.0001)；由P值可以得到A、D、A2、B2、C2和D2对高粱红色素吸光度的影响极显著，表明试验中各因素及因素之间的交互和响应值并不是简单的线性关系，二次项对响应值也有很大的影响，4个因素之间的相互作用对响应值的影响相对较小；失拟项的P值=0.5533>0.05，影响不显著，说明试验模型拟合良好，模型选择较为合理，模型的残差可能来自试验过程的随机误差。模型的修正决定系数RAdj2=0.8176，说明高粱红色素吸光值测定试验中81.76%的变异分布在方程的14个因子中，其总变异有18.24%不能由该模型来解释，R2值为0.9088，说明吸光值的实测值与预测值之间具有较好的拟合度，该模型可用于预测高粱红色素吸光值的实际情况。噪音信号比的比率(Adeq Precision)为12.303(>4)，说明本模型能真实地反映试验结果；试验的精确度(C.V.)为5.61%，说明试验操作可靠。由表3中的P值可知，各因素对高粱红色素提取的影响顺序为：乙醇浓度(A)>提取液pH(D)>提取时间(C)>料液比(B)，其中乙醇浓度和提取液pH对高粱红色素吸光值的影响极显著(P=0.0033和P=0.0045，均小于0.01)[15]。

通过三维响应面图和二维等高线图分析表明，随着乙醇浓度、料液比、提取时间和提取液pH值的增加，高粱红色素的吸收值也随之增加，但当这4个因素增加到一定程度时，高粱红色素的吸收值呈下降趋势，4个因素相互作用，对吸光度值的影响不显著，而从等高线图上看，椭圆度和密度也相当，符合回归分析模型的方差分析[16-17]。

2.3 最佳提取工艺条件的确定

通过对响应面法数据的分析，得出高粱红色素的最佳提取工艺：乙醇浓度为65.87%，提取时间为2.06 h，提取液pH值为2.89，料液比为1∶7.94，高粱红色素的吸光值为0.815。考虑到试验操作的可行性，对提取工艺进行了改进：乙醇浓度为65%，提取时间为2 h，提取液pH值为3.0，料液比为1∶8。

2.4 样品加标回收率及最佳条件的验证试验

通过3组样品加标回收试验结果计算得到回收率在96.52%～104.86%之间，说明索氏提取法提取高粱红色素准确、可靠。通过响应面试验筛选出高粱红色素的最佳提取工艺，并进行3组平行重复试验，验证响应面试验结果的可靠性和准确性。验证性试验测定高粱红色素吸光值分别为0.81，0.78和0.79。3组平行样数据的相对标准偏差(RSD)为2.65%，精密度和重复性均能满足要求，得出该提取工艺高粱红色素的吸光值较为稳定。并在该条件下对高粱红色素进行粗提，提取率约为25.2%，色价约为27.1(≥25)，符合国家标准。

3 结论

由响应面和方差分析可知，索氏提取法从高粱壳中提取高粱红色素的最佳工艺为提取时间2 h、料液比1∶8、乙醇浓度65%和提取液pH值为3.0。4个因素对提取率的影响程度为乙醇浓度>提取液pH>提取时间>料液比，乙醇浓度和提取液pH值对高粱红色素吸光值的影响极显著。样品加标回收率为96.52%～104.86%，RSD较小(2.65%)，说明索氏提取法提取高粱红色素工艺可靠、精准。高粱红色素的提取率约为25.2%，色价约为27.1(≥25)，符合国家标准。响应面试验可以对各种因素及其相互作用进行更全面、详细的分析，并能准确分析出因素的最佳组合，使试验稳定、可靠，为进一步探究高粱红色素的提取奠定了基础。