张霁红，康三江，胡生海，李玉梅，张芳

(1.甘肃省农业科学院农产品贮藏加工研究所，兰州 730070；2.甘肃省果蔬贮藏加工技术创新中心，兰州 730070)

梨是我国仅次于苹果、柑橘的第三大水果，种植面积大、产量高、营养丰富，每100 g果肉含水分80.3 g、蛋白质0.7 g、脂肪0.4 g、碳水化合物13.3 g、粗纤维4.4 g以及多种矿物质元素和维生素[1-2]，可替代粮食加工果醋。果醋富含不挥发性有机酸、Vc等营养成分，具有开胃健脾、帮助消化、增强代谢和防治动脉硬化、高血压等保健功能，是目前很有发展前途的新型水果加工品[3-4]。我国梨品种丰富，不同梨品种加工特性及加工品质差异较大[5-7]，不同梨品种、梨果实不同部位发酵梨醋菌种、条件、工艺、抗氧化性能研究及复合梨醋发酵研究均有报道[8-15]。梨醋传统发酵工艺是在梨汁中添加蔗糖、柠檬酸进行调糖和调酸，在适合的条件下添加菌种进行发酵，而发酵体系中氮源及无机盐方面的研究较少。本实验采用响应面法[16-18]研究碳源、氮源和无机盐对早酥梨醋发酵总酸的影响，旨在提高梨醋的工业化生产应用。

1 材料与方法

1.1 材料

早酥梨：购于甘肃省景泰县早酥梨产区；安琪果酒专用酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianus)：中国微生物菌种保存中心；蔗糖、柠檬酸、氯化铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠等(均为化学纯)：天津市光复科技发展有限公司；酵母膏、琼脂(生物试剂)：北京奥博星生物技术有限公司；果胶酶(酶活30000～50000 U/g)：宁夏和氏璧生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

BSA224S-CW电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；YXQ-LS立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司；ZHJH-C1112B超净工作台、ZWY-2102恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；LRH-250生化培养箱；TGL-16MC冷冻离心机 长沙维尔康湘鹰离心机有限公司；日本爱拓PAL-1数显糖度计。

1.3 实验方法

1.3.1 工艺流程

早酥梨清洗榨汁→酶解→杀菌→过滤→调整糖酸比→冷却→酒精发酵→醋酸发酵→过滤澄清→灭菌→陈酿→产品。

1.3.2 主要操作步骤

1.3.2.1 酶解

早酥梨清洗榨汁后，加入0.03%酶活30000～50000 U/g的果胶酶，pH值4.0，温度45 ℃，酶解2.5 h，75 ℃杀酶过滤。

1.3.2.2 酒精发酵

在糖酸比30～50的梨汁中加入总质量8%已活化的安琪果酒酵母，25 ℃发酵5 d。

1.3.2.3 醋酸发酵

当发酵液中糖度不再下降，酒精发酵结束时，接种梨汁总质量10%三级培养活化后的巴氏醋杆菌，32 ℃ 醋酸发酵6 d，杀菌、陈酿后得到梨醋。

1.3.3 分批补充碳源实验研究

在酶解后的早酥梨汁中一次性补充总质量6%的蔗糖，分别在发酵12，36 h时的发酵液中补充总质量3%的蔗糖，分别在发酵12，24，36 h时的发酵液中补充总质量2%的蔗糖，研究碳源对醋酸发酵中总酸含量的影响，每处理重复3次。

1.3.4 氮源浓度筛选

醋酸发酵初期在发酵液中分别添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的氯化铵，研究氯化铵添加量对醋酸发酵的影响，每处理重复3次。

1.3.5 无机盐浓度筛选

醋酸发酵初期在发酵液中分别添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的硫酸镁，0%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%的磷酸二氢钾，研究无机盐对醋酸发酵的影响，每处理重复3次。

1.3.6 Box-Behnken中心组合实验设计

根据Box-Behnken原理设计实验，每个因子被设置为高、中、低3个水平(-1，0，1)，各因子变量选择范围见表1。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 The factors and levels of response surface analysis

1.4 产品检测

1.4.1 发酵液中可溶性固形物的测定

采用日本产PAL-1型折光仪测定可溶性固形物含量。

1.4.2 总酸含量的测定

采用氢氧化钠酸碱滴定法测定总酸含量。

2 结果与分析

2.1 分批补充碳源对醋酸发酵结果的影响

图1 分批添加碳源对总酸含量的影响 Fig.1 Effect of adding carbon source in batches on total acid content

由图1可知，在酶解后的早酥梨汁中分3次添加总量6%的蔗糖进行果醋发酵，发酵结果显示：与对照相比，添加蔗糖可提高碳源物质含量，增加发酵液中的总酸含量。相同质量的蔗糖分1，2，3次添加后发酵液中总酸含量有明显差异，添加1次和添加2次差异不显著，添加3次与其他两次差异较显著。这是因为果醋发酵过程中糖转化为酒精，进一步生成乙酸，当糖浓度过高时，抑制酵母菌生长，影响糖的进一步转化，如果适量添加可进一步激活酵母生长，提高转化率。

2.2 不同氮源浓度对醋酸发酵结果的影响

在发酵液中分别添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的氯化铵后发酵液中总酸含量见图2。

图2 氯化铵添加量对总酸含量的影响Fig.2 Effect of ammonium chloride additive amount on total acid content

氮源主要参与氨基酸、蛋白质和核酸等菌体细胞构成及含氮物质代谢，无机氮源氯化铵有利于微生物快速利用，在梨醋发酵体系中加入适量的氯化铵可提高醋酸总量。由图2可知，当氯化铵添加量在0.1%～0.3%范围内可促进发酵体系中总酸量的积累，当氯化铵添加量大于0.4%时有抑制总酸产量的趋势。

2.3 不同无机盐浓度对醋酸发酵结果的影响

酒精发酵结束后在发酵液中分别添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的硫酸镁后发酵液中总酸含量见图3。

图3 硫酸镁添加量对总酸含量的影响Fig.3 Effect of magnesium sulfate additive amount on total acid content

酒精发酵结束后在发酵液中分别添加0%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%的磷酸二氢钾，研究微量元素钾对醋酸发酵的影响(见图4)，每处理重复3次。

图4 磷酸二氢钾添加量对总酸含量的影响

无机盐作为辅酶或酶活性基团的组成部分，是微生物维持生命活动的必需物质，K+能够影响细胞的通透性，维持细胞的渗透压，Mg2+是许多酶的催化剂，也是ATP的辅因子，能活化磷酸化酶和激酶参与发酵液中醋酸的合成。由图3和图4可知，当发酵液中加入0.1%～0.3%的硫酸镁、0.02%～0.06%的磷酸二氢钾时可促进发酵体系中总酸量的积累，当硫酸镁、磷酸二氢钾添加量增大时有抑制总酸产量的趋势。

2.4 响应面实验结果分析

利用Design-Expert 10软件进行实验设计及分析，相应设计及结果见表2，以总酸含量(g/L)为响应值，对数据进行多元回归拟合，得到总酸与各因素的二次多项回归方程为：总酸含量(g/L)=+59.25-1.31A+0.26B+0.97C+2.70AB+1.52AC-0.42BC-4.34A2-3.20B2-3.19C2。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Response surface test design and results

表3 回归模型方差分析结果

由表3方差分析结果可知，模型的P<0.01，说明该模型因子具有显著性意义。失拟项的P>0.05，不显著，回归方程R2=0.9804，拟合度较好，表明实验数据可以较好地反映各因素和总酸含量之间的关系。3个因素对梨醋总酸含量的影响大小依次为A氯化铵添加量(%)>C磷酸二氢钾添加量(%)>B硫酸镁添加量(%)。其中一次项A极显著，C显著，B不显著；二次项A2、B2、C2极显著，交互项AB、AC极显著，BC不显著，说明各因素对总酸含量的影响不呈线性关系。

2.5 响应面图及等高线图分析

根据回归方程，利用Design Expert 10软件绘制响应曲面图及等高线，见图5～图7。分析各因素及其相互作用对总酸含量的影响，确定最佳因素水平范围。从图中可直观地看出各因子对响应值的影响变化趋势，而且回归模型确实存在最大值。

图5 氯化铵、硫酸镁添加量对梨醋总酸含量影响的曲面图与等高线 Fig.5 The response surface and contour of the effect of ammonium chloride and magnesium sulfate on the total acid content of pear vinegar

由图5可知，总酸含量随着氯化铵和硫酸镁浓度的升高先增加后降低，当氯化铵浓度接近0.3%时，总酸含量趋于平稳，响应面相对陡峭，当A、B定量时，等高线呈椭圆形，表明A、B的交互作用显著。

由图6可知，总酸含量随着氯化铵和磷酸二氢钾浓度的升高先增加后降低，当磷酸二氢钾浓度大于0.05%～0.06%、氯化铵浓度大于0.25%～0.30%时，总酸含量下降，响应面相对陡峭，当A、C定量时，等高线呈椭圆，表明A、C的交互作用显著。

图7 硫酸镁、磷酸二氢钾添加量对梨醋总酸含量影响的曲面图与等高线 Fig.7 The response surface and contour of the effect of magnesium sulfate and potassium dihydrogen phosphate on the total acid content of pear vinegar

由图7可知，总酸含量随着硫酸镁和磷酸二氢钾浓度的升高先增加后降低，增加幅度较大，降低较小，响应面相对平缓，当B、C定量时，等高线呈圆形，表明B、C的交互作用不显著。

2.6 响应面模型验证

利用设计软件进行回归模型预测，总酸含量取最大值时各因素的优化水平为氯化铵添加量0.27%、硫酸镁添加量0.23%、磷酸二氢钾添加量0.05%，此时模型预测的总酸含量最大值为57.03 g/L。为了检验模型预测值的准确性，进行验证实验，在早酥梨酶解调糖调酸后，加入氯化铵0.27%、硫酸镁0.23%、磷酸二氢钾0.05%进行梨醋发酵，重复3次，测定总酸含量为56.72 g/L，与预测值接近，说明预测模型较好地反映了各因素与总酸之间的实际情况，优选工艺合理可行。

3 结论

在早酥梨醋发酵工艺中分批添加蔗糖可提高碳源的转化率，促进总酸含量的提高。 应用Box-Behnken中心组合实验设计对氯化铵、硫酸镁、磷酸二氢钾添加量对总酸含量的关系进行研究，通过Design Expert软件对实验结果进行分析，得到早酥梨醋优化发酵条件为氯化铵添加量0.27%、硫酸镁添加量0.23%、磷酸二氢钾添加量0.05%，总酸含量为57.03 g/L，较传统未添加果汁发酵总酸含量48.76 g/L提高了16.3%，表现出了良好的优化效果。