姜纳川,陈炼红

(西南民族大学 食品科学与技术学院，成都 610041)

奶酪是利用发酵剂和凝乳酶，使鲜奶中的蛋白质通过发酵使鲜奶凝固，在这个过程中，乳清会被逐渐排除掉，伴随着不断的发酵反应，直至发酵成熟后，会形成一种发酵型食品，具有很高的营养价值[1]。所谓霉菌奶酪，即通过霉菌这种发酵剂所制成的奶酪。在市面上，霉菌奶酪的类别有多种，可根据其口感、外观进行分类，如法国卡门贝尔奶酪和已打入中国市场的蓝纹奶酪、白霉奶酪等。目前，国外的奶酪产品种类丰富，具有较高的产量和销售量。然而，受饮食习惯的影响，奶酪在中国的发展远不如西方迅猛。近年来，随着国人健康意识的改观，奶酪也成为一个新的消费热点。但由于我国奶酪产业发展还不够完善，霉菌奶酪的研究仍处于起步阶段[2]，关于牦牛毛霉菌奶酪的研究更是鲜有报道。

奶酪的成熟过程涉及蛋白质分解、脂肪降解、糖酵解等很多生化反应，这对奶酪的品质和风味的保持具有重要意义。同时，成熟温度会对诸多生化反应产生重要影响。所以通过关注奶酪的成熟条件尤其是温度条件可以了解奶酪的特性变化。不同的奶酪，其对成熟所需具备的条件也会有所不同，包括成熟温度、时间及室内湿度等[3]。从目前的相关研究来看，针对不同成熟温度条件对牦牛毛霉菌奶酪品质所产生的影响的研究较少。

实验选取藏区牦牛奶，以雅致放射毛霉菌为发酵剂制作奶酪，分析牦牛毛霉菌奶酪成熟过程中理化性质的变化，并重点研究成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪品质的影响，以确定奶酪的最佳成熟温度。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牦牛乳：四川省红原县，密度为1.035 g/cm3，滴定酸度为18°T，蛋白质和脂肪的含量分别为4.62%、6.82%；雅致放射毛霉菌发酵剂：成都市调味品研究所；R-704发酵剂、小牛皱胃酶(酶活力14000 U/g)：科汉森公司；乙醇、硫酸铜、浓盐酸、三氯乙酸等分析纯：成都市科龙化工试剂厂。

CR-400色差仪 日本Konica Minolta公司；TA.XT Plus质构分析仪 英国Stable Micro System公司；MP512-02精密pH计 德国Matthaus公司；SKD-800凯氏定氮仪、SKD-08S2红外石英消化炉 上海沛欧分析仪器有限公司；Trace DSQ型气相色谱-质谱联用仪 美国Thermo公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头 美国Supelco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

新鲜牦牛乳→标准化→巴氏杀菌→冷却→添加发酵剂→调pH→添加氯化钙→添加凝乳酶→凝乳→切割→搅拌→堆酿→排乳清→压榨成型→半成品→切块→添加雅致放射毛霉菌→成熟→成品。

1.2.2 操作要点

新鲜牦牛乳在65 ℃下加热30 min，待冷却至32 ℃时，加入1%的发酵剂，然后搅拌均匀，32 ℃发酵之后，添加柠檬酸溶液，使牦牛乳的pH值调节到5.6，此时加入氯化钙与凝乳酶，体积比例分别为0.02%、0.04%，牛乳凝固之后进行切割、搅拌、排乳清的工序，压块成型，将半成品奶酪切块，块状尺寸30 mm3，在其表面均匀地喷洒0.3%(质量比)的雅致放射毛霉孢子液，在相对湿度为50%，温度分别在20，25，30 ℃的条件下，放置成熟。在成熟的过程中，分别在第0，2，4，6，8，10天测定奶酪的各项指标。

1.2.3 指标检测方法

1.2.3.1 感官评价

采用“三角测试”的方式，将本次实验的样品向评审员展示，结合表1的品评标准内容，对本次实验样品进行评分[4]。

表1 奶酪感官品评标准Table 1 The sensory evaluation standard of cheese

1.2.3.2 质构测定

参照李昂等的方法并加以修改进行测定[5]。干酪的硬度、黏性、弹性、凝聚性和咀嚼性等指标需要利用食品物性仪器进行测定。将样品分割为5 cm×5 cm×3 cm的方块，储存在4 ℃冰箱中；测定参数：负载类型Auto-5 g；测试速度1 mm/s；下压距离10 mm；保持时间0 s；探头回复速度1 mm/s；探头类型P0.5；每组干酪平行测定3次。

1.2.3.3 营养成分测定

水分含量的测定：参照GB 5009.3-2016中的相关方法[6]；灰分含量的测定：参照GB 5009.4-2016中的相关方法[7]；粗蛋白的测定：参照GB 5009.5-2016中的相关方法[8]；粗脂肪含量的测定：参照GB 5009.6-2016中的相关方法[9]。

1.2.3.4 色泽测定

对奶酪样品进行切块，从中间切开，用校准后的CR-400色差仪分别测定各个奶酪样品的切面，结果用L*(亮度)、a*(红度)、b*(黄度)表示[10]。

1.2.3.5 pH测定

在奶酪中加入质量比1∶1的蒸馏水，对其进行研磨处理，而后进行pH测定[11]。

1.2.3.6 pH 4.6醋酸盐缓冲液可溶性氮含量(pH 4.6-SN)

参照刘会平等的方法进行测定[12]。

1.2.3.7 12%三氯乙酸溶液可溶性氮含量(12% TCA-SN)

参照GB 5009.124-2016中的相关方法进行测定[13]。

1.2.3.8 硫代巴比妥酸值(TBAV)

结合相关文献，并对里面所用到的方法进行优化[14]。取8 g样品研磨后放入锥形瓶中，用字符m做标记。添加7.5%三氯乙酸(0.1% EDTA-2Na)40 mL，用保鲜膜封口，超声30 min后过滤。选取部分滤液4 mL，在其中加入4 mL TBA溶液，而后置于90 ℃的水浴锅内，水浴40 min后取出待其冷却，在1600 r/min条件下进行5 min的离心处理，再在上清液中加入氯仿4 mL，摇匀后将上清液取出，在523 nm和600 nm的条件下比色，参照以下公式计算：

1.2.3.9 酸价(ADV)

参照GB 5009.168-2016中的方法测定[15]。

1.2.3.10 牦牛毛霉菌奶酪成熟过程中挥发性物质变化

本次实验分析牦牛毛霉菌奶酪成熟过程中，其挥发性风味物质所属类别和相对含量，所采用的方法为顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用相结合的方法[16]。GC-MS测定的数据由仪器自带的系统软件(Xcalibur)进行分析处理，待鉴定化合物的质谱与NIST 08谱库中的质谱对比，列出匹配度大于70%的挥发性物质。

固相微萃取条件：取5 g奶酪样品放入20 mL顶空瓶中，将待吸附样品在80 ℃水浴中平衡30 min，然后将已经老化好的萃取头插入顶空瓶中进行萃取，吸附时间30 min。萃取结束后取出萃取头，插入气相色谱仪汽化室中进行GC-MS分析。

气相色谱条件：氦气作载气，流速1 mL/min，样品通过DB-Wax(30 m×0.25 mm，0.25 μm)毛细管柱。色谱升温程序：起始柱温40 ℃，保持3 min，以8 ℃/min升到100 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min升到200 ℃，最后以10 ℃/min升到220 ℃，保持3 min。

质谱条件：电子电离源(electron ionization，EI)，电子能量70 eV，离子源温度220 ℃，四极杆温度150 ℃，扫描模式Scan，质量扫描范围40～650 m/z。

1.3 数据处理分析

本实验中的所有数据均为3次重复测定的平均值，结果表示方式为平均值±标准差。结合SPSS 20.0软件，对实验数据进行统计分析处理，从而得出平均值和标准差，再运用Duncan多重比较的方法，分析显著性方差，得出显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪感官指标的影响

不同成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪感官的影响见图1。

图1 牦牛毛霉菌奶酪的感官评分Fig.1 The sensory scores of yak Mucor cheese

由图1可知，随着成熟时间的延长，牦牛毛霉菌奶酪的感官评分呈先上升后下降的趋势，在第6天达到峰值。在成熟前期(0～2 d)，成熟温度为30 ℃时的牦牛毛霉菌奶酪感官评分高于另外两组；第6天时，在25 ℃温度条件下培养的牦牛毛霉菌奶酪感官评分高于另外两组。这是因为毛霉生长受温度的影响，低温时霉菌的生长和代谢较慢，所以成熟速度较慢；温度升高，菌丝生长速度加快，不易产生孢子，蛋白质与脂肪均属于较好分解的物质，因此成熟的速度被提升，可以促进奶酪形成最佳的组织状态，口感也更佳；虽然在高温下，霉菌初期阶段能得到快速生长，但由于高温的影响，蛋白质会加剧分解，损坏奶酪的内部组织结构，致使感官品质受到严重影响。

2.2 成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪质构指标的影响

成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪质构指标影响的结果见表2。

表2 成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪质构的影响Table 2 Effect of ripening temperature on the texture of yak Mucor cheese

续 表

由表2可知，无论是哪一组牦牛毛霉菌奶酪实验，在成熟的过程中，奶酪的硬度、胶黏性、弹性、咀嚼性均呈先上升后下降的趋势，凝聚性呈下降趋势。变化显著的为硬度、胶黏性、咀嚼性(P<0.05)；弹性于第4天开始变化显著，第6天达到峰值，之后呈下降趋势(P<0.05)；凝聚性变化趋势不显著(P>0.05)。当成熟温度为25 ℃时，牦牛毛霉菌奶酪的胶黏性、凝聚性、弹性、咀嚼性高于另外两组，升高成熟温度，硬度的变化趋势为逐渐下降。这是因为温度较低时，霉菌发酵活力低，不易分解奶酪中的脂肪，奶酪的硬度较大，温度升高，奶酪中脂肪分解加快，硬度逐渐下降，引起奶酪结构变化，而温度越高，酪蛋白水解程度越大，奶酪的质构越受影响。当成熟温度为25 ℃时，质构指标较为理想，组织状态良好。培养前期，酪蛋白降解作用和凝聚作用速度较快，霉菌发酵作用促进脂肪的分解，此时各指标均呈现上升的趋势。因此，不同的成熟温度对奶酪质构特性的影响显著。在产品生产时，通过调整成熟温度可有效控制产品的质构指标。

2.3 成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪营养成分的影响

成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪营养成分影响的结果见表3。

表3 成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪营养成分的影响

由表3可知，3组牦牛毛霉菌奶酪的水分含量随着成熟时间的增加大体呈显著下降趋势(P<0.05)。成熟温度25 ℃的水分含量一直高于另外两组(P>0.05)；灰分随着成熟时间的增加呈逐渐上升趋势(P<0.05)，随着成熟温度的升高和成熟时间的延长，蛋白质含量、脂肪含量和水分含量均呈下降趋势，但下降趋势不明显(P>0.05)；不同温度对蛋白质和脂肪的影响不显著(P>0.05)。原因在于奶酪中的水分以不同形式存在，而温度的升高使奶酪表面的水分因蒸发作用而减少，并且会因为蛋白质降解破坏奶酪内部结构，引起结合水的变化，酪蛋白分子间的聚集和乳清的排出，使奶块脱水收缩。同时，较高的成熟温度可使微生物繁殖和代谢加快，从而引起奶酪中酶活力增强，多肽降解反应加快。在微生物和酶的作用下，酪蛋白水合作用增强更倾向于水解，蛋白质和脂肪降解形成许多小肽和氨基酸等物质，导致蛋白质和脂肪含量下降。在奶酪成熟过程中，矿质元素等无机盐成分没有消耗，而其他营养成分含量的降低使奶酪总体质量减少，加之蛋白质网状结构的固着作用，使灰分含量呈上升趋势。

2.4 成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪色泽变化的影响

在20，25，30 ℃ 3种成熟温度下，牦牛毛霉菌奶酪成熟期间的色泽变化结果见图2。

图2 奶酪成熟期间L*值的变化Fig.2 The changes in L* values of cheese during ripening period

由图2可知，随着奶酪成熟时间的延长，L*值呈先上升后下降的趋势，在第6天达到峰值。这是因为温度升高，蛋白酶和肽酶活性增强，蛋白质更容易分解，亮度值较高的酪蛋白数量减少越快，所以L*值降低。奶酪成熟初期，脂肪分解速率大于蛋白质分解速率，酪蛋白数量降低不明显，所以L*值上升。奶酪成熟至第6天时，蛋白质分解速率超过脂肪分解速率，脂肪在呈色物质中比例上升，所以L*值下降。

成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪a*值的影响见图3。

图3 奶酪成熟期间a*值的变化

由图3可知，牦牛毛霉菌奶酪成熟过程中，当成熟温度为30 ℃时，奶酪的a*值高于另外两组，且随着奶酪的成熟，a*值呈上升的趋势。这是因为成熟前期，奶酪中的红绿色素被脂类物质包裹，所以颜色偏绿，红绿值为负。且成熟温度越高，脂类物质更容易被乳酸菌和凝乳酶分解，奶酪中的红绿色素释放更快，成熟超过6 d，奶酪逐渐呈现出应有的色泽。

成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪b*值的影响见图4。

图4 奶酪成熟期间b*值的变化Fig.4 The changes in b* values of cheese during ripening period

由图4可知，牦牛毛霉菌奶酪成熟过程中，奶酪的b*值随着温度的升高而上升，且随着奶酪的成熟，b*值呈上升趋势。这是因为随着成熟时间的延长，蛋白质不断被乳酸菌和凝乳酶分解，部分酪蛋白的网状结构被破坏，且温度越高，破坏越严重，脂肪逐渐释放出来，奶酪中游离的黄色素增多，所以b*值不断升高。

2.5 成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪pH的影响

成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪pH影响的结果见图5。

图5 奶酪成熟期间pH的变化Fig.5 The changes in pH values of cheese during ripening period

由图5可知，随着成熟温度的升高，pH值的下降幅度逐渐增大；随着成熟时间的延长，pH值先大幅度下降后降幅减缓或稍有上升。这是因为温度越高，奶酪中胶体磷酸钙的溶解性降低，使磷酸钙数量增加，H+从PO43-中分解出，从而使H+含量增加[17]。另外，霉菌活性也随温度升高而增强，霉菌活性越强，酸化能力越强，奶酪蛋白质含量的迅速降低和水分含量的增加影响了对乳酸的缓冲能力，所以pH值的下降幅度越大。成熟前期，发酵剂处于生长期，并且奶酪中的乳糖转化成乳酸的过程使pH值不断降低，第6天后，酸度过大对霉菌活性起抑制作用，使其酸化能力降低，此时乳糖几乎分解完毕，有些细胞呈现自溶现象且产生碱性物质，奶酪的pH值有所增加或下降速度降低。

2.6 成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪蛋白质分解指标的影响

2.6.1 醋酸盐缓冲液中可溶性氮含量的测定

成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪醋酸盐缓冲液中可溶性氮含量影响的结果见图6。

图6 牦牛毛霉菌奶酪成熟过程中pH 4.6可溶性氮含量的变化Fig.6 The changes in soluble nitrogen content at pH 4.6 of yak Mucor cheese during ripening

由图6可知，随着成熟时间的推移，pH 4.6可溶性氮含量会逐渐增高，且在成熟温度25 ℃时，pH 4.6可溶性氮含量最高。这是由于成熟温度过低或过高时，毛霉活力不高，发酵程度不足，蛋白质分解能力差。同时，在成熟初期，pH 4.6可溶性氮含量上升趋势较快、变化较大，这是由于干酪成熟初期凝血酶活性较高，促使酪蛋白加快了水解的速度。在成熟达到一定阶段，此时pH 4.6可溶性氮含量会逐渐减缓上升速度，这就反映出两个现象：一是凝乳酶的活力下降，二是蛋白质水解速度降低[18]。

2.6.2 12%三氯乙酸(TCA)可溶性氮含量的测定

成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪12%三氯乙酸可溶性氮含量影响的结果见图7。

图7 牦牛毛霉菌奶酪成熟过程中12%三氯乙酸可溶性氮含量的变化Fig.7 The changes in soluble nitrogen content of 12% trichloroacetic acid of yak Mucor cheese during ripening

在牦牛毛霉菌奶酪成熟过程中，12%三氯乙酸可溶性氮含量一直呈上升趋势，这也证实了酪蛋白在奶酪成熟的过程中会发生强烈的水解。在成熟温度为25 ℃下成熟时，12%三氯乙酸可溶性氮含量最高。这主要是因为此时毛霉和细菌都会产生大量的蛋白酶，蛋白酶活性不断提高，酪蛋白会引发降解的现象，从而将大肽分解成小肽和氨基酸。

2.7 成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪脂肪分解指标的影响

2.7.1 酸价的变化

成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪酸价变化的影响见图8。

图8 霉菌牦牛奶酪成熟过程中酸价的变化Fig.8 The changes in acid values of yak Mucor cheese during ripening

由图8可知，随着成熟时间的延长，奶酪的酸价逐渐升高，说明脂肪的水解过程一直在持续。前期增长较快，后期趋于稳定，这主要是奶酪成熟过程中干酪脂肪不断降解以及霉菌与凝乳酶丧失活力造成的。奶酪中的脂肪分解后会产生醇类、酯类、醛类以及游离脂肪酸等风味物质，是构成奶酪独特风味的重要因素。

2.7.2 硫代巴比妥酸值的变化

成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪硫代巴比妥酸值影响的结果见图9。

图9 霉菌牦牛奶酪成熟过程中硫代巴比妥酸值的变化

由图9可知，在成熟温度为25 ℃时，奶酪的硫代巴比妥酸值最高。随着成熟时间延长，奶酪的硫代巴比妥酸值逐渐升高，说明在奶酪成熟过程中脂肪一直在发生氧化反应。并且上升速率随时间的增加而增大，这是由于在成熟温度为25 ℃时，菌株活力好，脂肪的氧化程度高，随着奶酪成熟时间延长，脂肪氧化速率也在增加。

2.8 成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪挥发性成分的影响

表4 成熟温度对牦牛毛霉菌奶酪风味物质的影响

由表4可知，从样品中检测得出的风味物质成分有很多种，包括酮类、醇类、酸类、醛类、酯类等，含量最高的化合物为酸类化合物。在成熟温度为25 ℃条件下，成熟到第6天时，所检测到的风味物质含量达到了最高值，约为96.74%。

在奶酪发酵和成熟的过程中，由于脂肪或者氨基酸的降解，形成了牦牛毛霉菌奶酪中的酸类化合物，而这正是用以评价奶酪成熟的重要标志之一。在成熟的过程中，挥发性酸的含量是比较大的，这类物质即便是在不同的发酵阶段，其相对含量也会比较高，但随着成熟时间的推移，总体的含量也会逐渐减少[19]。对于此类型奶酪，虽然酮类物质以丁酮及甲基酮化合物为主，但总的含量比重并不大。酯类物质包含5种化合物，即癸酸乙酯、癸酸丙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯，而黄油酯则是这几种物质的混合物总称[20]。浓郁奶香是酯类物质的特征，这种特征对奶酪香气的形成起到重要的作用。

3 结论

在成熟温度为25 ℃、成熟时间为6 d时，奶酪有着最佳的质构指标。伴随着成熟时间的推移，3组牦牛毛霉菌奶酪的感官评分与质构指标呈先上升后下降的趋势，在第6天时达到峰值；而蛋白质含量、水分含量、脂肪含量都呈现逐渐下降的趋势，其中下降最为显著的为水分含量(P<0.05)；灰分含量呈上升趋势(P<0.05)；红绿值(a*)和黄蓝值(b*)呈上升趋势，亮度值(L*)呈下降趋势；pH值呈先下降后不变或略微上升的趋势；pH 4.6可溶性氮含量、12%三氯乙酸可溶性氮含量均呈上升趋势，蛋白质不断分解。在同一成熟时间点，温度为25 ℃的胶黏性、凝聚性、弹性、咀嚼性明显高于其他两组(P<0.05)；温度为25 ℃的水分含量高于其他两组(P>0.05)；灰分含量、蛋白质含量和脂肪含量变化不显著(P>0.05)。通过检测得知，当成熟温度在25 ℃条件下，成熟时间为6 d时，奶酪的风味物质含量为最高值。

结合实验结果，综合各项评定指标得出结果：当牦牛毛霉菌奶酪处于成熟温度25 ℃条件下，成熟时间为6 d时，奶酪的品质最佳。