周 翔，顾 达，童 聪，曾佳慧，吴泓飞，赵祥安

(1.如皋市中医院，江苏 南通 223001；2.扬州大学，江苏 扬州 225009；3.南京医科大学，江苏 南京 210000；4.扬州大学临床医学院，江苏 扬州 225009)

肝纤维化是由慢性肝损伤修复过程中弥漫性细胞外基质过度沉积引起的[1]。多种慢性肝病(Chronic liver disease，CLD)都可引起肝纤维化，以慢性乙型肝炎为例，全世界约有3.5亿慢性乙型肝炎患者，约25%最终发展为肝纤维化[2]。如不及时治疗，肝纤维化会进展为失代偿期肝硬化，并引起各种严重并发症，如食管静脉曲张和原发性肝癌等[2]。对家庭和社会构成严重威胁。

近年来研究发现，在急慢性肝脏炎症中，外周循环中的单核细胞被招募到受损的肝组织中，然后分泌促炎细胞因子-白细胞介素(Interleukin，IL)-1β、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α，加重肝细胞损伤，并且释放促纤维化细胞因子-转化生长因子(Transforming growth factor-β，TGF)-β1和血小板源性生长因子(Platelet derived growth factor，PDGF)促进肝纤维化[3-4]。同时最新的研究发现，肝纤维化时单核细胞浸润主要依赖于单核细胞趋化因子-1(Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)[5- 6]。通过抑制MCP-1分泌减少单核细胞浸润是治疗肝纤维化的重要靶点。

鳖甲煎丸具有活血化瘀功效，是治疗肝纤维化的经典方剂。已有研究表明，鳖甲煎丸能有效降低慢性乙型肝炎合并肝硬化患者血清肝纤维化指数透明质酸、层粘连蛋白、Ⅳ型胶原和Ⅲ型前胶原[7-9]。但其抗肝纤维化的机制不完全明确。中医理论认为血瘀是肝纤维化的关键病机，而单核细胞黏附肝窦内皮细胞并向肝脏浸润是肝纤维化时血瘀的重要机制之一[10-12]。本课题拟观察鳖甲煎丸对肝纤维化模型小鼠肝脏炎症、纤维化的作用，并进一步观察肝组织内单核细胞浸润和单核细胞相关细胞因子分泌，最终观察MCP-1的表达。本研究有助于揭示鳖甲煎丸活血化瘀抗肝纤维化的科学内涵，为鳖甲煎丸抗肝纤维化临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞 C57/B6雄性小鼠40只，6～8周龄，体重20～22 g，购自江苏集萃药康生物技术有限公司[许可证号：SYXK(苏)2009-0017]，在南京鼓楼医院动物实验中心饲养。实验环境温度控制在(23 ± 2) ℃，相对湿度为50%。给小鼠喂食高压灭菌的食物和过滤水，并在实验前适应1周。

1.2 实验药物及试剂 鳖甲煎丸(Z42020772)，四氯化碳(Carbon tetrachloride，CCl4)(20161011)。橄榄油(2015060702)。WB一抗抗体MCP-1(ab246795)。WB二抗-辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG(CW010M)。免疫组化一抗CD11b(ab133357)、F4/80(ab16911)、α-SMA(ab5694)、Col-I(ab254349)。免疫组化二抗-辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG(PV-6001)。Trizol试剂盒(5596-019)，DEPC水(R0021)，q-PCR反转录试剂盒(RR420A)，DMEM培养基(C11995500BT)，胎牛血清(10091-148)，双抗(15140-122)，q-PCR荧光试剂盒(RR036A)。

1.3 实验仪器 Applied biosystems Quant StudioTM 6 Flex Real-time-PCR仪(美国Life Technologies)，Applied biosystems 2720 thermal cycler型RNA逆转录仪(美国Life Technologies)，Power Pac TM Universal型电泳仪(美国BIO-RAD公司)，Tanon 5200 Multi型全自动数码凝胶成像分析系统(上海天能科技有限公司)，V2 S02型涡旋振荡器(德国 IKA)，IKA mini G型微型离心机(德国 IKA)，Heraeus Fresco 21冷冻高速离心机(美国Thermo Fisher)，Bx60型生物显微镜(日本 Olympus)。

1.4 实验方法

1.4.1 肝纤维化模型建立和鳖甲煎丸干预:通过腹腔注射CCl4建立小鼠肝纤维化模型[13]，按3 μl/g的剂量腹腔注射橄榄油稀释的CCl4(CCl4∶橄榄油=1∶4)，每周2次，共4周。空白对照组腹腔注射等体积的橄榄油。灌胃前鳖甲煎丸用0.5%羧甲基纤维素钠(Sodium carboxymethyl cellulose,CMC-NA)溶液溶解和重悬，根据我们前期动物实验研究结果和已发表文献报道设定高剂量组为2.20 g/(kg·d)、中剂量组为1.10 g/(kg·d)、低剂量组按0.55 g/(kg·d)。最后1次给药后48 h内，麻醉处死小鼠。收集血清和肝组织进行后续研究。

1.4.2 肝酶测定:采用生化仪(Beckman-coulter)临床检测技术检测各组肝酶水平，包括谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)和谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)。

1.4.3 肝组织病理学观察:肝组织HE和Masson染色方法如下。小鼠肝组织在4%多聚甲醛中固定24 h后，进一步脱水，石蜡包埋，最后切片为3 μm薄片。根据标准方案对切片进行苏木精-伊红(HE)染色和Masson染色。

1.4.4 肝组织免疫组化:将制备的小鼠肝脏切片依次进行脱蜡、透明化和抗原修复。然后，将切片与各种一抗α-SMA、Col-I、F4/80、CD11b在4 ℃孵育过夜。次日，免疫组化二抗孵育：37 ℃，30 min。最后，DAB染色，苏木精显核，中性树脂胶固定。

1.4.5 肝组织定量实时PCR:利用Trizol(15596-026)从冷冻肝脏中提取总RNA，并用Prime Script RT-Master Mix试剂盒进一步转化为cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒在Step-One Plus(Applied Biosystems)上进行定量实时PCR。表1所列引物由Primer Bank网站获得，北京擎科新产业生物技术有限公司合成，β-actin用于基因表达的内参。

表1 qRT-PCR指标的引物序列

1.4.6 蛋白质印迹(WB):按照总蛋白提取试剂盒提取小鼠肝脏总蛋白。蛋白质经双氰胺酸法定量后，用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到聚偏氟乙烯膜上。室温下用3%牛血清白蛋白封闭膜2 h，然后用分别一抗孵育：MCP-1(稀释1∶2000)或GAPDH(稀释1∶2000)，在4 ℃下孵育过夜。次日，利用辣根过氧化物酶IgG室温下共孵育2 h，最后用Western Bright TM ECL试剂盒显色。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，用t检验。统计图表制作采用Graph-Pad-prism6软件。本研究采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 鳖甲煎丸降低CCl4诱导的肝脏炎症 见表2(图1)。CCl4组小鼠腹腔内反复注射CCl4后，肝组织出现肝细胞坏死、白细胞浸润和小叶结构受损。CCl4组ALT、AST较对照组明显升高。相比于CCl4组，鳖甲煎丸组特别是高剂量组小鼠肝组织ALT和AST明显降低，肝细胞坏死、白细胞浸润和小叶结构受损减轻。以上结果提示，鳖甲煎丸能有效地逆转CCl4所致的肝脏炎症。

表2 各组小鼠血清ALT、AST表达(U/L)

图1 各组小鼠肝脏形态学变化(HE染色，×100)

2.2 鳖甲煎丸减轻CCl4诱导的HSCs活化和胶原沉积 通过Masson染色观察鳖甲煎丸对CCl4诱导的胶原沉积的影响。CCl4组小鼠腹腔内反复注射CCl4后，肝脏出现大量胶原沉积，而鳖甲煎丸组小鼠肝脏胶原沉积明显减少。HSCs增殖活化后，可以表达大量α-SMA和分泌Col-I。通过α-SMA和Col-I免疫组化，发现鳖甲煎丸，尤其是大剂量鳖甲煎丸能有效降低CCl4诱导的HSCs活化和Col-I沉积。通过计算Masson染色、α-SMA和Col-I免疫组化学染色的像素比，发现鳖甲煎丸和CCl4组小鼠的Masson染色、α-SMA和Col-I免疫组化比例较模型小鼠的Masson染色、α-SMA和Col-I免疫组化比例明显降低，具有统计学意义(图2)。

图2 各组小鼠肝脏形态学变化(Masson染色、Col-I和α-SMA免疫组化，×100)

2.3 鳖甲煎丸减少单核细胞相关细胞因子的表达 见表3。单核细胞通过分泌IL-1β、TNF-α等促炎细胞因子和TGF-β1、PDGF等促纤维化细胞因子加重肝纤维化[3,14-15]。如图3A所示，反复腹腔注射CCl4后，CCl4组小鼠肝脏中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、PDGF的肝内mRNA表达显著增加，鳖甲煎丸给药后这些表达均降低。同时，与低剂量鳖甲煎丸比较，高剂量鳖甲煎丸对IL-1β、TNF-α、TGF-β1、PDGF表达的抑制作用更强。

表3 各组小鼠肝脏中促炎和促纤维化细胞因子mRNA表达比较

图3 各组小鼠肝脏形态学变化(CD11b和F4/80免疫组化，×200)

2.4 鳖甲煎丸抑制单核细胞浸润 为了验证鳖甲煎丸能减少单核细胞相关细胞因子的分泌，研究进一步通过免疫组化观察了小鼠肝脏中单核细胞数量的变化。 F4/80免疫组化结果提示，在CCl4腹腔注射4周后，小鼠肝组织F4/80+巨噬细胞较正常对照组明显増多，而鳖甲煎丸组小鼠肝组织F4/80+巨噬细胞数量较CCl4组明显减少。CD11b为单核细胞标记。免疫组化结果提示，CCl4组小鼠肝组织中CD11b+单核细胞较正常对照组明显增多，而给予鳖甲煎丸干预后，单核细胞浸润明显减少(图3)。

2.5 鳖甲煎丸通过抑制MCP-1分泌减少单核细胞黏附 见表4。MCP-1/CCR2轴在肝纤维化过程中单核细胞浸润肝脏起关键作用[6]。反复注射CCl4后，小鼠肝脏MCP-1 mRNA表达增加。与CCl4组比较，鳖甲煎丸组小鼠肝脏表达MCP-1 mRNA明显减少。为了证实这一发现，研究进一步通过WB检测MCP-1的蛋白表达。鳖甲煎丸组小鼠，特别是高剂量组小鼠肝脏MCP-1表达较CCl4组小鼠明显减低(图4)。

表4 各组小鼠肝脏MCP-1 mRNA和蛋白表达比较

图4 各组小鼠肝脏中MCP-1蛋白表达

3 讨 论

肝纤维化是多种慢性肝病共同的病理生理过程[16-17]。主要表现为广泛的肝细胞坏死、细胞外基质过度沉积引起的正常肝组织破坏、假小叶和再生结节形成，最终导致门脉高压相关性疾病、低蛋白血症等多种严重并发症的产生。尽管现代医学对肝纤维化的发病机制研究颇深，但目前仍无针对性药物[18]。

中医学里并无“肝纤维化”名词，根据其临床表现可分属“臌胀”“癥瘕”“积聚”等病范畴。中医认为肝纤维化病机主要为外感湿热之邪或感染疫毒，或饮酒过度酿生湿热，羁留不去，渐致肝、脾、肾功能失调，气血、津液搏结，以致肝络瘀阻，日久则成积聚。中医药治疗肝纤维化积累了上千年的临床经验，创造了多个针对肝纤维化的经典方剂，如扶正化瘀方、柔肝方、鳖甲煎丸等。其中鳖甲煎丸是治疗肝纤维化的经方，全方以鳖甲为君药，软坚散结，破瘕消积；以大黄、牡丹皮、桃仁、芍药为臣药，活血消胀、祛瘀生新；配以鼠妇、蜣螂、虫消积破坚；瞿麦、石苇利水祛湿；柴胡、桂枝、厚朴、黄芩等疏理气机；半夏、射干、葶苈子祛痰散结；人参、阿胶、白芍补养气血。纵观鳖甲煎丸全方，药物众多，以软坚散结药为君，配以大量活血之品，并佐行气、除湿、消痰、攻结、扶正，多用于治疗正虚邪久不出的“积聚”“癥瘕”等病症，被《肝硬化诊治指南(2019版)》推荐使用。多项临床实验证实有效[19-20]，但其药效机制仍知之甚少，这也阻碍了鳖甲煎丸在临床使用。本研究通过腹腔注射CCl4建立小鼠肝纤维化模型。分别给予不同剂量的鳖甲煎丸灌胃。结果表明，CCl4组小鼠肝脏炎症和纤维化程度明显高于对照组，说明肝纤维化模型建立成功。通过鳖甲煎丸治疗后，CCl4组肝细胞凋亡明显减少，肝脏炎症减轻。同时发现鳖甲煎丸能减轻HSCs活化，减少胶原沉积。

既往研究认为，肝脏急慢性炎症过程中，HSCs被活化，分泌大量细胞外基质(ECM)，引起ECM分泌和降解失衡，导致肝纤维化[21]。近年来越来越多证据表明，单核细胞可以通过多种途径活化HSCs和加重肝纤维化，被认为是肝纤维化的“调控者”[22-25]。单核细胞可以分泌TGF-β1和PDGF促进HSCs的活化、增殖，分泌ECM加重肝纤维化。同时还能分泌TNF-α、IL-1β等细胞因子通过NF-κB通路促进活化的HSCs存活[3-4]。此外，单核细胞还能通过分泌血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A，VEGFA)，促进病理性的血管生成[26-27]。因此，如何抑制单核细胞浸润成为治疗肝纤维化的重要靶点。在本研究中，我们发现鳖甲煎丸灌胃给药后，肝纤维化模型小鼠肝脏中PDGF、TGF-β1、TNF-α、IL-1β 等促炎促纤维化细胞因子明显减少。进一步研究发现，鳖甲煎丸灌胃小鼠肝脏中单核细胞浸润减少。目前研究表明MCP-1是促进单核细胞浸润的关键因子[28-31]。本研究显示鳖甲煎丸灌胃后，纤维化模型小鼠肝脏中MCP-1分泌减少。这些结果也提示，鳖甲煎丸可能是通过抑制MCP-1分泌减少单核细胞浸润。

综上所述，本研究证实了鳖甲煎丸的抗炎、抗纤维化作用，其机制可能与抑制单核细胞浸润，进而减少单核细胞相关促炎促纤维化细胞因子分泌有关。本研究进一步证实了以单核细胞为靶点治疗肝纤维化的可能，同时揭示了鳖甲煎丸抗肝纤维化的部分机制。本研究有助于揭示鳖甲煎丸活血化瘀抗肝纤维化的科学内涵，为其抗肝纤维化临床应用提供理论依据。