于芳春，刘向国，方 芳，谢桂元，吴百合

(安徽中医药大学，安徽 合肥 230031)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是常见的呼吸系统疾病，反复的气道及肺组织炎症浸润是COPD的发病机制之一。免疫机制在COPD炎症启动、恶化和维持中发挥重要作用，免疫功能的紊乱如T淋巴细胞尤其是辅助性T细胞(T helper cells，Th细胞)的分泌和表达失衡可直接导致COPD的发生[1]。机体正常情况下，Th1/Th2系统维持相对平衡状态，临床上可以通过监测Th1/Th2细胞因子的表达情况，进行诊断疾病和判断预后[2]，Th1或Th2的优势状态可由Th1/Th2的比值体现。白细胞介素4(Interleukin-4，IL-4)和干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)作为Th1、Th2细胞的代表因子，对其比值的探究可以揭示免疫机制在COPD发生发展中的作用。具有补气功效的六味补气方可以缓解COPD患者咳嗽咳痰、呼吸困难、气短乏力等症状，控制气道炎症的发生发展，改善肺功能和免疫功能[3]，但其免疫学机制尚未明确，本研究基于Th1/Th2类细胞平衡的免疫理论进行探究。烟草中的烟碱等有机成分及吸烟形成的颗粒是导致COPD发生发展的独立危险因素[4-5]，本研究通过香烟烟熏联合脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)制备COPD大鼠模型，使用六味补气方进行干预，进一步探索六味补气方治疗COPD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 选取鼠龄为42～49 d的健康SD雄性大鼠40只，SPF级，体重(180±20)g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，生产许可证号：SCXY(鲁)20190003，饲养于安徽中医药大学动物房，环境温度21～25 ℃，相对湿度50%～70%。按照随机数字表法分为正常对照组、模型组、桂龙咳喘宁组、六味补气方组，每组10只，自由进食及饮水，适应性喂养1周后进行实验。

1.2 药物与试剂 六味补气方组方药物：炙黄芪15 g，生晒参、玉竹各10 g，益智仁、陈皮各6 g，肉桂3 g，由安徽省中医院中药房提供；桂龙咳喘宁片购自江西药都仁合制药有限公司，0.5 g/片，批号：Z20053135；LPS购自Solarbio生物科技公司,批号:L8880；红三环牌卷烟购自滁州卷烟厂：焦油含量13 mg，烟碱含量1.1 mg，批号：CZYC6901028128742；IL-4 ELISA检测试剂盒，批号：KS14667，IFN-γ ELISA检测试剂盒，批号：KS14536，均购于科顺生物科技公司。

1.3 实验仪器 烟熏箱(1 m×1 m×1 m)，自制；动物肺功能检测仪(型号Ani Rws 2005，北京贝兰博公司)，石蜡切片机，(型号RM2016，上海徕卡仪器有限公司)，生物组织石蜡包埋机(型号JB-P5，武汉俊杰电子有限公司)，台式高速冷冻离心机(型号Eppen-dorf5424，德国艾本德有限公司)，正置光学显微镜(型号NIKONECLPSE Ci，日本尼康公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠COPD模型制作：参照宋一平等[6]采用香烟烟雾联合气管内滴入LPS的造模方法，除正常对照组外，其余各组大鼠分别于实验的第1天和第14天，使用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，手术暴露气管，注入LPS(1 ml/1 mg)200 μl至气管内。除LPS滴入当日，其余每日进行卷烟烟熏：将大鼠置于自制的烟熏箱中，20支卷烟混合100 g锯末点燃烟熏，每日烟熏1次，每次烟熏30 min，共计烟熏造模4周。COPD模型制作成功的标准依据大鼠一般情况变化如呼吸系统改变、咳嗽、呼吸道痰鸣音及分泌物增多，大鼠肺功能降低，肺组织病理学变化如肺组织黏膜下炎性细胞侵蚀、支气管狭窄等进行评价。

1.4.2 药物干预：每组大鼠于造模第5周第1天开始灌胃干预，1次/d，持续15 d。正常对照组和模型组大鼠分别灌服相应剂量的0.9%氯化钠溶液10 ml/(kg·d)，桂龙咳喘宁组大鼠灌服桂龙咳喘宁片混悬液0.82 g/(kg·d)(相当于成人常规临床用量的10倍)，六味补气方组大鼠灌服六味补气方混悬液1.06 g/(kg·d)(相当于成人常规临床用量的20倍)，为课题组前期研究的有效实验剂量。

1.5 观察指标及方法 实验期间每日观察并记录大鼠呼吸、进食、排泄、精神及活动等状况；于造模第4周结束和药物干预结束后测定各组大鼠肺功能：3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，手术露出气管并插管，采用肺功能检测仪记录系统中呼气峰流速(Peak expiratory flow，PEF)、第0.3秒用力呼气容积(Forced expiratory volumein 0.3 seconds，FEV0.3)、用力肺活量(Forced vital capacity，FVC)、及FEV 0.3与FVC的比值(FEV0.3/FVC)。待大鼠肺功能检测完毕后，进行腹主动脉取血；收集肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)：露颈部气管，于气管上剪一小口，插入针管并用缝合线扎紧固定，通过反复注入0.9%氯化钠溶液抽吸后收集BALF，将血液与BALF分别注入试管，3000 r/min离心5 min，抽取血清及BALF上清液，ELISA法检测IL-4、IFN-γ水平。打开胸腔，取出肺组织，冲洗并置于4%多聚甲醛中固定48 h后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、连续5 μm厚切片，作苏木精-伊红(HE)染色，光镜观察肺组织的病理学改变并摄片。

1.6 统计学方法 采用SPSS 26.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐时选择LSD法，方差不齐时比较选择Tamhane’s T2检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况及呼吸系统症状的变化 正常对照组大鼠精神良好，毛发光泽，呼吸、抓鼻、体重增长等均正常；与正常对照组相比，模型组大鼠出现喉间及气道痰鸣音、咳嗽咳喘，食欲降低，神疲倦嗜卧，毛发枯槁无泽，脱毛明显、活动减少等表现，随着造模时间推移，上述表现逐渐增加。药物干预组大鼠在造模期间表现与模型组相同，经药物干预后，用药组大鼠一般情况和呼吸系统症状均有不同程度改善，以六味补气方组改善最为明显。

2.2 大鼠肺功能的变化 见表1。与正常对照组相比，模型组大鼠FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC(%)和PEF值均明显下降(P<0.05)；与模型组相比，桂龙咳喘宁组和六味补气方组大鼠FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC(%)和PEF值均明显增高(P<0.05)；与桂龙咳喘宁相比，六味补气方组大鼠FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC(%)和PEF值均明显增高(P<0.05)，FEV0.3值增高无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠肺功能参数比较

2.3 大鼠肺组织的病理学变化 正常对照组大鼠气管及各级支气管结构完整，黏膜上皮细胞未破坏，纤毛规整未见倒状、粘连，无腺体肥大增生及黏液、炎性细胞浸润、支气管管腔扩大，肺泡壁、肺间隔未见异常。与正常对照组相比，模型组大鼠气管及支气管变窄，黏膜上皮出现破损，甚至坏死剥落，大量炎性细胞侵蚀肺间质和肺实质，支气管黏膜下肌层增生肥厚，细支气管、肺泡管和肺泡囊扩大，部分肺泡萎陷相互融合构成肺大疱；与模型组相比，桂龙咳喘宁组和六味补气方组大鼠气道炎性浸润减轻，支气管黏膜和肺组织病理学有不同程度改善，其中以六味补气方组改善最为明显(图1)。

图1 各组大鼠肺组织病理形态学比较(HE染色，×200)

2.4 各组大鼠血清及BALF中IL-4、IFN-γ水平的变化 见表2、3。与正常对照组相比，模型组血清及BALF中IFN-γ水平明显下降，IL-4水平明显升高(均P<0.05)；与模型组相比，桂龙咳喘宁组和六味补气方组血清及BALF中IFN-γ水平明显升高，IL-4水平明显下降(均P<0.05)；与桂龙咳喘宁组相比，六味补气方组血清及BALF中IFN-γ水平明显升高，IL-4水平明显下降(均P<0.05)。

表2 各组大鼠血清中IL-4、IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比较

表3 各组大鼠BALF中IL-4、IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比较

3 讨 论

COPD多属于中医学“肺胀”的范畴，以胸部胀满，憋闷如塞，气促喘息，咳嗽痰多为临床表现，严重者可见烦躁，甚则出现惊厥、神昏、喘脱等危重证候，反复发作，迁延不愈[7]。病因病机为正气虚弱，外感六淫之邪，本质为本虚标实，痰饮为最主要的病理因素之一。COPD治疗上以“补肺气”为根本方法[3]，稳定期以补虚扶正为主，急性加重期以宣肺祛邪、降气化痰、活血化瘀为主。现代医学尚未完全明确COPD的发病机制，但炎症机制在其病程进展中发挥重要作用，被激活的炎症细胞同时释放多种炎性介质对肺部结构进行破坏，同时促进中性粒细胞炎症反应[8]。COPD患者存在气道黏膜免疫缺陷及紊乱，免疫紊乱常与Th1/Th2、Th17/调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg细胞)失衡有关[9]。临床中的免疫状态相关指标众多，其中Th1/Th2是与免疫功能密切相关的指标，且其中的各类细胞因子对机体的炎性应激程度有积极的反应价值[10]。

Th1和Th2细胞同属具备免疫调节作用的T细胞亚群，COPD患者存在Th1细胞因子水平下降，Th2细胞因子水平升高，即出现Th2型细胞因子优势反应[11]。Th1细胞数量与肺气肿严重程度相关，可通过分泌炎症细胞因子调节气道炎症，其细胞水平下降使机体清除感染源的能力降低[12-13]。Th2细胞的增多会引起炎症和慢性组织损伤，导致气道壁增厚[14]，进一步削弱机体对感染因子的保护防御机制，并引发过敏反应，这可能是诱发COPD急性加重、急性期感染不易控制的原因之一[15]，纠正Th1/Th2型细胞因子失衡，保持其动态平衡，对防治COPD大有裨益。

IFN-γ是一种调节细胞免疫功能的小分子多肽，Th1细胞主要通过分泌IFN-γ参与细胞免疫应答，发挥抗细胞内病原体感染的作用，其水平可直接反映Th1的表达程度[16]。IFN-γ具有高度的种属特异性，可通过激活血管内皮细胞和中性粒细胞，导致炎症介质的释放，并促进CD4+T淋巴细胞与内皮细胞的黏附，引起气道炎症及呼吸爆发[17]。IFN-γ还可拮抗Th2对细胞因子的分泌作用，导致Th1/Th2失衡加剧与异常的炎症反应及免疫应答[18]。COPD的发生和急性加重也与IFN-γ的表达密切相关，其过度表达可破坏患者气道和肺泡内的蛋白酶-抗蛋白酶系统平衡，导致气道炎症和肺泡壁的溶解破裂[19]；IL-4是由CD4+T细胞中Th2和CD8+Tc2细胞分泌的一种具有多种生物活性的细胞因子，是Th2细胞最具代表性的细胞因子。IL-4水平升高能抑制Th1细胞水平和活性，可促进内皮细胞黏附分子的表达，增加内皮细胞与淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞的结合而引起气道乃至全身的炎症细胞浸润加剧，亦能诱导释放促嗜酸性粒细胞聚集的细胞因子和促炎因子，增加气道黏液分泌，促进成纤维细胞的趋化和激活，导致气道重塑[20]。IL-4还参与肺气肿的发生，其通过刺激基质金属蛋白酶-2(Matrix metallo proteinases-2，MMP-2)、MMP-9的基因转录，引起蛋白酶/抗蛋白酶失衡，导致细胞外基质的沉积和胶原纤维的增生[21]。基于此，本研究通过观察IFN-γ、IL-4在COPD模型大鼠中浓度的改变，评价Th1/Th2平衡的失调，从而揭示六味补气方干预COPD的作用途径。

西药常用β受体激动、促进支气管扩张的药物成分和糖皮质激素联合发挥长效药性治疗COPD，但长期使用上述药物不良反应较为明显[22]，中医药在治疗COPD具有整体调节与安全有效的独特优势，以辨证论治为指导原则，标本兼顾，对症治疗[23]。六味补气方是安徽中医药大学第一附属医院特色院内制剂，是名老中医经验的传承，组方中炙黄芪益气固表补中，生晒参行气活血、补脾益肺，益智仁温脾固肾，助参、芪补气，三药从脾、肺、肾三脏补气；玉竹滋阴润燥、生津止渴，陈皮理气健脾、燥湿化痰，肉桂温中散寒。全方阴阳、寒温相济，补中寓通不留邪。实验证明六味补气方可明显改善COPD患者咳嗽、气喘、胸闷等症状[2]。现代医学研究发现，组方中炙黄芪其有效成分黄芪多糖与黄芪甲苷与可诱导细胞产生IFN-γ，发挥较强的免疫调节作用[24]；生晒参主要成分人参皂苷Rh1可通过抑制IFN-γ释放，促进IL-4表达，抑制炎症因子表达、调节免疫反应和改善肺组织病理变化[25]；玉竹活性成分C(玉竹多糖)能有效刺激IFN-γ释放，发挥抗炎和调节免疫作用，诱导偏向Th2型免疫应答[26]。课题组前期动物实验也表明，六味补气方可以抑制COPD模型大鼠血清及BALF中IL-8、IL-1β、TNF-α等炎症因子的释放，缓解气道炎症。

本研究结果显示，COPD模型大鼠经六味补气方和桂龙咳喘宁干预后，一定程度上减少了COPD模型大鼠肺功能的恶化，肺组织炎性细胞浸润及感染减少，大鼠气道阻塞情况改善，肺通气功能缓解。模型组大鼠较正常对照组大鼠肺组织损伤严重，血清及BALF中IL-4含量升高，IFN-γ含量降低，予以药物干预后治疗组大鼠IL-4含量降低，IFN-γ水平升高，提示气道慢性炎症和反复感染的情况得以缓解；模型组大鼠的IFN-γ/IL-4的比值较正常对照组显著降低，说明模型组存在Th1/Th2平衡向Th2方向移动，呈现Th2优势状态。与药物干预治疗后，IFN-γ/IL-4的比值升高，Th1/Th2平衡向Th1方向移动，出现了Th1/Th2的比值逆转，提示吞噬细胞介导的宿主细胞免疫防御反应增强，感染被有效控制。

综上所述，六味补气方改善COPD模型大鼠肺功能，减少肺组织炎性细胞的浸润及感染，增强其免疫力，增加IFN-γ及减少IL-4含量，纠正Th1/Th2失衡，是通过调节T细胞介导的获得性免疫实现的。Th1、Th2分泌诸多细胞表面物质，IL-4、IFN-γ只是迄今为止最有代表性的一种，完全具有特异性及鉴别性质的因子有待进一步研究挖掘。