葛子靖，王莘智，徐豫湘，范伏元，田 英，刘 丹

(湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一类自身免疫性疾病，具有极高的致残率[1]。主流观点认为，免疫细胞、因子都对RA的发展有决定性的影响[2]。T细胞的稳态无疑是RA基础研究及防治的关键核心[3]。T细胞的稳态对适应性免疫系统发挥正常功能至关重要。自噬可调节T 细胞的存活及分化，并在T 细胞稳态中发挥重要作用。PTPN22是维持T细胞稳态的关键基因，且可调节自噬依赖性的免疫因子的释放[3]。研究发现，TRAF3可通过PTPN22调节T细胞受体(TCR)信号通路[4]。根据上述研究成果进行合理地推测，RA的发病机制可能是TRAF3/PTPN22信号通路表达异常，影响Beclin1介导的T细胞自噬，从而导致T细胞稳态失衡，进而诱发RA的发生。通痹颗粒对“气血亏虚、寒湿痹阻”型RA患者疗效显著；实验研究表明其能改善患者中医证候，并能减少血清血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)水平[5-7]。本研究试从T细胞自噬角度阐明通痹颗粒治疗RA的作用机制，为中药防治类风湿关节炎的研究提供新的思路与靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：Wistar大鼠：雄性，平均体重(1000±20) g，鼠龄 8～10周，清洁级。从上海斯莱克实验动物有限公司购买。

1.1.2 实验药物：受试中药为通痹颗粒，由当归、全蝎、没药、白芍、乳香、川芎、桂枝、黄芪、僵蚕、黄柏等组成，来源于湖南中医药大学第一附属医院，属院内制剂。制备方法：取通痹颗粒6 g，用10 ml无菌0.9%氯化钠溶液溶解，摇匀，制成0.6 g/ml药液，放至4 ℃冰箱中保存备用。

西药阳性药：雷公藤多苷片(浓度1 mg/ml)，灌胃，剂量8.75 ml/kg，1次/d，连续16 d。

1.1.3 主要试剂：完全弗氏佐剂 (CFA) ，购于 Sigma公司(批号:SLBQ1106 V)。Beclin1自噬信号Vps34的阻断剂3-MA，可购于Sigma公司。TNF-α、TGF-β、IL-1试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。TRAF3、PTPN22和Beclin1抗体购自英国Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 造模与分组：采用CFA的方法复制RA大鼠模型。除正常组外，其余大鼠均向右后足垫部皮内注射CFA 0.15 ml。24 h后大鼠右足踝部出现急性炎性肿胀，48 h后大鼠足致炎侧、非致炎侧或双侧前肢关节有肿胀，有的大鼠甚至耳、尾部出现炎性结节，在致炎7 d后注射第2次，8～12 d则制成佐剂性关节炎模型[8],致炎后淘汰造模不成功大鼠，选取病变明显大鼠 48只适应性饲养3 d后，根据体重随机分为五组，即：RA模型组(灌胃0.9%氯化钠溶液)、雷公藤多苷组(灌胃雷公藤多苷药液)、通痹颗粒组(灌胃通痹颗粒药液)、3-MA组(灌胃Beclin1自噬信号Vps34的阻断剂3-MA)、联合组(同时灌胃Beclin1自噬信号Vps34的阻断剂3-MA和通痹颗粒药液)，另设正常对照组。治疗组大鼠采用成人剂量的3倍用药，2次/d，连续16 d。正常对照组以等容积的蒸馏水代替。16 d后处死各组大鼠，按要求留取血样及组织作相关指标检测。

1.2.2 样本采集与指标检测：①大鼠整体指标评价采用千分卡尺测量每组后足跖厚度，每3 d检查大鼠并记录和分析数据，全面评估大鼠关节炎指数和后爪关节肿胀度。②血液学检测：治疗16 d后所有大鼠断头取血分离血清备测，采用悬液芯片检测大鼠血清中细胞因子IL-1、TGF-β、TNF-α的含量。检测流程严格按照悬液芯片检测操作流程进行。③信号通路相关蛋白和基因的检测：取关节滑膜组织30 mg，加入200 μl 蛋白裂解液彻底混匀。冰上组织裂解 15 min，匀浆后离心 10 min。取上清，用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后，将各样本蛋白浓度调整至相同，将定量好的各样本按1∶1比例加入上样缓冲液混匀，煮沸变性 5 min 后保存于-20 ℃ 备用。采用Western blot技术检测TRAF3基因和PTPN22、Beclin1蛋白的表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，用t检验和组间方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠右足跖厚度比较 见表1。治疗后各治疗组大鼠右足跖厚度均低于RA模型组(P<0.05)。雷公藤多苷组、3-MA组、通痹颗粒组三组之间比较大鼠右足跖厚度均无统计学差异(P>0.05)。联合组大鼠右足跖厚度明显低于其他治疗组(P<0.05)。

2.2 大鼠关节炎指数比较 见表2。治疗后各治疗组大鼠关节炎指数均低于RA模型组(P<0.05)。雷公藤多苷组、3-MA组、通痹颗粒组三组之间比较大鼠关节炎指数均无统计学差异，联合组大鼠关节炎指数明显低于其他治疗组(P<0.05)。

2.3 大鼠血清IL-1、TNF-α、TGF-β水平比较 见表3。治疗后各治疗组血清IL-1、TNF-α水平均低于RA模型组(P<0.05)。雷公藤多苷组、3-MA组、通痹颗粒组三组之间比较，大鼠血清IL-1、TNF-α水平均无统计学差异(P>0.05)，联合组血清IL-1、TNF-α水平均明显低于其他治疗组。治疗后各治疗组血清TGF-β水平均高于RA模型组(P<0.05)。雷公藤多苷组、3-MA组、通痹颗粒组三组之间比较,大鼠血清TGF-β水平均无统计学差异(P>0.05) ，联合组血清TGF-β水平均明显高于其他治疗组(P<0.05)。

表3 大鼠血清IL-1、TNF-α、TGF-β水平比较

2.4 大鼠TRAF3基因、PTPN22和Beclin1蛋白表达比较 见表4。与正常对照组比较，RA模型组TRAF3基因表达水平下调，PTPN22蛋白和Beclin1蛋白表达上调(均P<0.05)。与RA模型组相比，雷公藤多苷组、3-MA组、通痹颗粒组TRAF3基因表达水平上调，PTPN22蛋白Beclin1蛋白表达下调(均P<0.05)，三组之间比较，各项指标无统计学差异(均P>0.05)。联合组滑膜组织TRAF3蛋白表达水平与其他治疗组相比上调，PTPN22蛋白和Beclin1蛋白表达下调(均P<0.05)。

表4 大鼠TRAF3基因、PTPN22和

3 讨 论

T细胞的稳态是RA基础研究及防治的关键核心。T 细胞稳态是指外周T 细胞通过细胞存活及增殖等来维持自身数目平衡，从而行使正常的免疫功能，当T细胞的稳态发生变化可影响RA的发生和发展[9-10]。T细胞的稳态对免疫系统发挥正常功能、抵制病原体至关重要。机体通过调控T细胞的增殖与凋亡调节外周T细胞数目，以便T细胞群迅速响应，识别并清除病原体[11-12]。RA患者T细胞免疫耐受降低并伴随着其凋亡程度的减少[13]。

越来越多的研究提示自噬在T 细胞稳态中具有重要作用。自噬可调节T 细胞的存活及分化，且与T细胞稳态密切相关。自噬的增多或者降低可打破T细胞的稳态，导致免疫系统紊乱[14]。最近研究发现，PTPN22基因是引发RA的关键原因[15-16]。PTPN22能够编码磷酸酶，通过将T细胞信号通路中的关键分子去磷酸化而抑制TCR的信号活性。PTPN22的降低导致NLRP3介导的 IL-1β分泌缺失，而PTPN22基因增加可以促进炎性系统的激活[17]，同时，PTPN22以自噬依赖的方式调节NLRP3介导的IL-1β分泌。最新研究发现， TRAF3 可控制PTPN22 从胞质向胞膜的转移，并抑制PTPN22 在TCR复合物亚基中的去磷酸化[17-19]。Beclin1可与Vps34共同调节自噬体膜的合成和物质转运[20]。综上所述， RA的发病机制可能是TRAF3/PTPN22信号通路表达异常，影响Beclin1介导的T细胞自噬，从而导致其稳态失衡，诱发RA的发生。

类风湿关节炎属于中医学“痹证”的范畴，《素问·痹论》云：“风寒湿三气杂至，合而为痹”，此言其外因。故《素问·评热病论》指出：“风雨寒热，不得虚，不能独伤人”，又指出：“不与风寒湿气合，故不为痹”。说明外因只是发病的条件，内因才是发病的根本原因[21]。因此，RA乃本虚标实之证，内因主要为患者病久肝肾气血营卫内虚；外因是风寒湿热侵袭。其病机主要表现为气血亏虚、寒湿痹阻、营卫不和、阴阳失调等，治当以益气养血，祛风除湿，通络止痛为法[22]。

通痹颗粒是本课题组研发治疗RA的中药复方，由当归、白芍、黄芪、川芎、全蝎、僵蚕、乳香、没药、桂枝、黄柏等组成，具有益气养血、祛风除湿之效，可有效缓解RA的症状并降低RA患者血清中的炎症因子[23]。方中以当归为君，白芍、黄芪为臣，川芎、全蝎、僵蚕、乳香、没药、桂枝、黄柏为佐药。当归养血活血；白芍与川芎共用活血调气，助君药活血化瘀，养血健脾；黄芪大补气血；乳香、没药活血生肌，散瘀止痛；全蝎、僵蚕通络止痛；桂枝通经散寒;黄柏清热解毒；甘草调和诸药，共奏活血调气、通络止痛、清热利湿的功效。

本研究结果显示，与正常对照组比较，RA模型组IL-1、TNF-α血清水平显著增加，关节炎指数以及足跖肿胀明显上调。再次证实了RA模型组大鼠炎性指标的异常表达与关节损伤有密切联系。通痹颗粒组以及联合组的IL-1、TNF-α血清水平显著降低，关节炎指数以及足跖肿胀明显下降，说明通痹颗粒组能够有效抑制炎症反应，保护RA患者关节。本研究结果显示，与正常对照组比较，RA模型组TRAF3基因表达水平下调，PTPN22蛋白Beclin1蛋白表达上调，提示RA模型组大鼠滑膜免疫炎性损伤与TRAF3低表达和PTPN22蛋白以及Beclin1蛋白高表达相关。与RA模型组比较，通痹颗粒组以及联合组滑膜组织TRAF3蛋白表达水平显著上调，PTPN22蛋白和Beclin1蛋白低表达，表明通痹颗粒组抑制RA模型大鼠滑膜炎症反应可能与其上调免疫炎性抑制蛋白 TRAF3，下调PTPN22和Beclin1蛋白的表达相关。

综上所述，通痹颗粒方治疗RA模型大鼠的机制可能与上调TRAF3基因，下调PTPN22和Beclin1的表达，从而抑制T细胞自噬，使T细胞的稳态得到恢复，减少炎症细胞因子释放，缓解大鼠关节肿胀和关节炎状态，起到治疗RA的作用。