蔡 婉，周 华，葛 文，王 婧，池 浩

(上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203)

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是动脉的一种慢性炎症性病变[1]。动脉粥样硬化主要是巨噬细胞衍生的泡沫细胞在血管壁积累，炎症反应[2]及氧化应激[3-4]反应出现在AS形成的各个阶段。因此抗炎及抗氧化应激是治疗AS的重要靶点。中医认为，气虚、痰浊和血液是AS的重要病理因素[5-6]。气虚则血流不畅，脉道受阻，化瘀生痰，因此AS病机为本虚标实[7-8]。研究显示，多种中药单体具有改善血脂，抑制炎症、抗氧化，抑制血液聚集等多种途径改善AS[9-10]。清脂化瘀颗粒针对AS病因病机，以清热解毒化瘀为法，前期研究显示，清脂化瘀颗粒可以有效减轻颈动脉粥样硬化程度，稳定斑块，减轻炎症及氧化应激反应。颈动脉斑块超声影像表现与既往研究相似[11],但其抗动脉粥样硬化的具体分子机制尚不清楚。

维持机体氧化还原反应平衡需要很多调节因子共同作用，其中核因子E2相关因子-2(Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)是主要调节因子[12-13]。正常情况下，Nrf2因子与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(ECH-associated protein-1，Keap-1)蛋白结合位于细胞质中，当氧化应激因子过多时，Nrf2与Keap-1解离，转位与细胞核，与细胞核中抗氧化结合原件(Antioxidant responsive element，ARE)结合，从而通过此途径激活机体内抗氧化系统，最终起到减轻氧化损伤作用。因此，Keap-1/Nrf2/ARE是机体重要的内源性抗氧化信号通路[14-15]。本研究使用高脂饮食喂养的载脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠作为主动脉粥样硬化的动脉模型，观察清脂化瘀颗粒是都通过调控Keap-1/Nrf2/ARE信号通路从而减轻氧化应激所导致的动脉粥样硬化损伤。

1 材料与方法

1.1 实验动物 载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)雄性小鼠30只，体重(20±2) g，C57BL/6野生雄性小鼠10只，体重(20±2) g。所有实验动物均购于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK(沪)2017-0011]。所有实验动物饲养于室温(25±1)℃，湿度(50±5)%的实验动物中心，期间可自由饮食饮水。

1.2 动物模型制备与分组 所有动物适应性喂养1周后，将30只ApoE-/-小鼠随机分为模型组(ApoE-/-)，阿托伐他汀组(ApoE-/-+阿托伐他汀)，清脂化瘀颗粒组(ApoE-/-+清脂化瘀颗粒)。每日给予高脂饲料(购自于HFK生物科学公司)；8周后阿托伐他汀组与清脂化瘀颗粒组每日灌胃阿托伐他汀25 mg/(kg·d)及清脂化瘀颗粒130 mg/(kg·d)，连续4周；C57BL/6野生雄性小鼠10只作为对照组，每日灌胃等体积的0.9%氯化钠溶液。

1.3 实验药物与试剂 清脂化瘀颗粒由虎杖6 g，炒黄芩9 g，黄精、冬葵子、刺山柑果实各10 g，生蒲黄12 g，六味中药组成。由上海中医药大学附属曙光医院制剂室提供配方颗粒

1.4 血脂检测 小鼠处死前12 h禁食不禁水，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血，静置后，3500 r/min离心25 min，-80 ℃保存。采用全自动生化检测仪检测小鼠血清中总胆固醇(Total cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)含量。

1.5 血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和亚铁离子(Fe2+)水平检测 采用上述保存于-80 ℃环境的血清，严格按照所购试剂盒上的说明书检测各组小鼠血清中SOD、MDA、GSH及Fe2+水平，记录结果。

1.6 HE染色法主动脉组织学形态检测 将实验小鼠主动脉组织于4%多聚甲醛固定24 h后，根据HE染色常规方法进行，光学显微镜下观察各小鼠主动脉组织形态。

1.7 Western blot蛋白印迹定量分析 全自动蛋白印迹定量分析系统检测主动脉组织中Nrf2、Keap-1蛋白表达水平。取主动脉组织，使用蛋白提取试剂盒提取蛋白，采用PAGE电泳，将分离得到的蛋白通过湿法转移到疏水性的聚偏二氟乙烯膜；用转移到膜上的蛋白当作抗原，使之与第一抗体相结合后再与荧光标记的第二抗体杂交结合，最后通过底物显色以检测目的蛋白的表达水平。将导出的图片用Image J软件进行扫描，得到蛋白条带灰度值，然后计算出每个蛋白条带对应的蛋白表达量，将所得数值用Graph Pad Prism软件绘制出不同蛋白表达量的统计图。

1.8 统计学方法 采用SPSS 25.0统计学软件分析所得实验数据，计量资料以均数±标准差表述，两组间比较采用方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠血清血脂水平比较 结果显示，与对照组相比，模型组小鼠血清中TC、TG、LDL含量均显著升高，其中HDL含量显著降低(P<0.01)；与模型组相比，清脂化瘀颗粒组与阿托伐他汀组血清中TC、TG、LDL含量均显著降低(P<0.01)。与阿托伐他汀组相比，清脂化瘀颗粒组血清中TG、TC、LDL含量差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠血脂水平比较(mmol/L)

2.2 各组小鼠主动脉组织形态学变化 与对照组相比，模型组、阿托伐他汀组、清脂化瘀颗粒组主动脉内有较大斑块形成；与模型组相比，阿托伐他汀组与清脂化瘀颗粒组主动脉内膜斑块明显缩小；阿托伐他汀组与清脂化瘀颗粒组主动脉内膜斑块差异不明显(图1)。

A：对照组；B：模型组；C：阿托伐他汀组；D：清脂化瘀颗粒组

2.3 各组小鼠血清中SOD、MDA、GSH、Fe2+水平变化 结果显示，与对照组相比，模型组血清中SOD、GSH水平显著降低(均P<0.01)，MDA、Fe2+水平显著升高(均P<0.01)；此外，与模型组相比，阿托伐他汀组、清脂化瘀颗粒组血清中SOD、GSH水平显著升高(均P<0.01)，MDA、Fe2+水平显著降低(均P<0.01)。与阿托伐他汀组相比，清脂化瘀颗粒组血清SOD、GSH、MDA水平差异均无统计学意义(P>0.05)，Fe2+水平显著下降(P<0.01)。见表2、3。

表2 各组小鼠炎症因子水平比较

表3 各组小鼠血清中Fe2+浓度比较(mmol/L)

2.4 各组小鼠主动脉Nrf2、Keap-1蛋白表达水平比较 与对照组相比，模型组小鼠主动脉及斑块内，Keap-1水平升高；与模型组相比，阿托伐他汀组与清脂化瘀颗粒组小鼠主动脉及斑块中Nrf2蛋白表达显著增加，Keap-1水平显著下降。阿托伐他汀组与清脂化瘀颗粒组两组小鼠主动脉及斑块中Nrf2及Keap-1蛋白表达无统计学差异。见图2(表4)。

图2 各组小鼠主动脉Keap-1、Nrf2蛋白的表达

表4 清脂化瘀颗粒对Keap-1、Nrf2蛋白表达的影响

3 讨 论

本研究使用高脂饮食喂养的ApoE基因敲除小鼠作为动脉粥样硬化的动物模型，结果表明，清脂化瘀颗粒能通过上调Keap-1/Nrf2/ARE介导的抗氧化信号通路从而减轻氧化应激所致的动脉粥样硬化。

动脉粥样硬化是一种由机体脂质异常代谢驱动的动脉内膜炎症性疾病，是当代多发的脑梗死、心绞痛、心肌梗死等多种心脑血管疾病的病理基础。脂质过氧化、斑块内出血和铁沉积是晚期AS斑块的特征[16]。多项近期的基础研究表明，氧化应激过程导致的氧化型LDL生成所致血管舒张功能异常，是AS血管损伤的内在基础[17-18]。因此，提出维持细胞内氧化还原过程平衡的治疗策略对于抗动脉粥样硬化保护心脑血管系统来说是至关重要的。而Keap-1/Nrf2/ARE信号通路是调控细胞氧化应激的重要信号通路，是维持细胞内氧化还原稳态的中枢调节者。Nrf2/ARE信号通路是细胞内广泛的细胞抗氧化途径[19]。有研究显示，Nrf2敲除的动物较正常动物更易受到氧化应激的毒害[20]。正常情况下，Keap-1/Nrf2/ARE抗氧化信号通路由Nrf2、ARE、Keap-1三个核心分子构成。Nrf2作为核转录因子，可对外界化学物质和自由基刺激发生防御性响应。Nrf2蛋白在体内半衰期较短，正常时Nrf2与Keap-1蛋白结合锚定在细胞质中，并因Keap-1经Cul3途径不断被泛素化降解，因此自由少数Nrf2能进入细胞核发挥促基因表达的功能。当Keap-1的氨基酸残基受到ROS等亲电性较强的物质攻击后，Nrf2可以从Keap-1上解离。Nrf2向细胞内扩散，与ARE结合，启动下游抗氧化蛋白、解毒酶等基因表达，从而发挥抵抗作用[21]。

Vinchi等[22]研究表明细胞铁死亡机制可以减轻小鼠主动脉内皮细胞脂质过氧化和AS。铁死亡相关蛋白受Nrf2水平调控，通过与Keap-1-Nrf2解体，活化的Nrf2激活调控下游铁死亡相关蛋白表达，从而保护细胞免受过度的氧化应激损伤[23]。因此，Keap-1/Nrf2/ARE在动脉粥样硬化抗氧化机制中发挥重要作用。铁死亡是一种铁依赖性的细胞程序性死亡方式，其特征表现为细胞抗氧化能力降低，导致过氧化脂质水平过度增高，致死性积累。

本研究的结果表明，与模型组相比，阿托伐他汀组及清脂化瘀颗粒组小鼠主动脉组织中Nrf2蛋白表达增加，Keap-1含量减少，血清中氧化应激因子减少，表明清脂化瘀颗粒抗动脉粥样硬化作用可能是通过激活Keap-1/Nrf2/ARE信号通路，上调Ntf2水平，过量的Nrf2从细胞质转移入细胞核内，与ARE结合，启动下游基因表达，从而上调SOD、GSH水平，下调MDA，从而实现其抗氧化应激的作用，减轻动脉粥样硬化的损伤。此外，此次研究测定了Fe2+含量，我们研究发现，与模型组、阿托伐他汀组相比，清脂化瘀颗粒组Fe2+含量显著下降，因此，清脂化瘀颗粒可能是通过减少铁蓄积及脂质过氧化从而达到抗动脉粥样硬化作用。因此，抑制血管内皮内细胞铁死亡可能是清脂化瘀颗粒抗动脉粥样硬化的潜在机制。