杨春静，时正媛，续茜桥，宝 丽，游龙泰，倪 健

(1.首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京 100038；2.北京中医药大学中药学院，北京 100029)

注意缺陷多动障碍(Attention deficit hyperactivity disorder，ADHD)是多始发于儿童时期并延续至成年的神经精神疾病，俗称小儿多动症。近年来由于环境、教育等因素，ADHD的发病率有逐年增高的趋势。研究表明，ADHD的病因与氧化应激有关[1-3]。治疗ADHD的药物主要包括中枢兴奋剂、中枢NE调节剂等，但容易出现头痛、影响患儿生长发育等不良反应[4-5]。鉴于ADHD病因复杂、病程长的特点结合中药多成分、多靶点、不良反应小的优势，研究及开发治疗ADHD的中药复方意义重大。

静宁颗粒是北京中医药大学东直门医院儿科王俊宏主任医师的临床经验方，治疗ADHD疗效显著。原方由太子参、熟地、枸杞子、五味子、远志、石菖蒲、茯苓等组成，主要适用于气阴两虚证的小儿多动症。目前关于静宁颗粒的研究主要集中于HPA轴、神经递质等方面[6]，而对其抗氧化作用的研究很少。因此，本课题通过对原代皮层神经元采取过氧化氢(H2O2)刺激，模拟氧化应激损伤过程，观察静宁颗粒对H2O2诱导的原代皮层神经元氧化损伤的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂与仪器 怀孕14 d的C57BL/6孕鼠购自斯贝福生物技术有限公司(北京)。静宁颗粒干浸膏(实验室自制，溶液澄清，pH=7.1，渗透压=305 mOsm)；H2O2溶液(天津化学试剂厂)；NEUROBASAL MED SFM培养基、马血清、Hank’s平衡盐溶液、谷氨酰胺、葡萄糖溶液、B27 Supplement多聚鸟氨酸购自Gibco生命科技公司(美国)；青霉素-链霉素混合液(北京索莱宝科技有限公司)；MTT染色液(北京拜尔迪生物技术有限公司)；DAPI染色液、活性氧检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒购自南京碧云天生物技术有限公司；微量还原型谷胱甘肽测试盒、丙二醛检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液、PMSF试液、BCA蛋白定量试剂盒、脱脂奶粉购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；Bax、Bcl-2、p53、HO-1和Nrf2等购自Cell Signaling Technology(美国)。

流式细胞仪(美国)；DG-300C电泳仪(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；DYCZ-24DN型垂直电泳装置(北京市六一仪器厂)；VE-386型转移电泳槽(北京原平皓生物技术有限公司)；超声波细胞粉碎机(宁波科技生物有限公司)。

1.2 原代皮层神经元细胞提取及传代培养 取怀孕14 d的小鼠(经首都医科大学附属北京世纪坛医院科学研究伦理委员会批准)，脱颈椎处死，用75%乙醇擦拭肚皮消毒，取出胎鼠。迅速将其移至装有PBS溶液的培养皿。然后将胎鼠置解剖显微镜分离左右脑和脑干，剪掉嗅球，剥离脑膜，剪取颜色浅的部分即得透明月牙形的皮层，用显微剪剪碎。以上所有操作均在冰上进行。用预热的0.1%的胰酶，在37 ℃培养箱中消化10～15 min。消化结束后，吸弃胰酶，用预先配置好的培养基清洗两次以洗掉残余的胰酶。然后加入培养基，轻轻吹打至被全部吹散。用200目的细胞筛过滤、计数、种板。在生物安全柜中静置15 min后，放入到培养箱中培养。种板后4 h，换液。每隔1 d换1次，每次1/3换液。

1.3 静宁颗粒对原代神经元细胞活力的影响 将原代神经元接种于96孔板，培养至第9天时进行分组处理，分为空白组、各用药组(2.5、2.0、1.6、0.8、0.4、0.2 mg/ml静宁颗粒)，MTT法检测细胞活力[7]。

1.4 H2O2造模浓度的筛选 将原代神经元接种于96孔板，培养至第9天时进行分组处理，采用不同浓度(800、400、200、100、50 μmol/L)H2O2处理细胞2 h。MTT法考察不同浓度的H2O2溶液对原代神经元活力的影响，从而筛选H2O2最佳造模浓度。

1.5 细胞分组 将原代皮层神经元细胞分为五组：空白组、模型组、静宁颗粒低剂量组(0.2 mg/ml)、静宁颗粒中剂量组(0.4 mg/ml)、静宁颗粒高剂量组(0.8 mg/ml)。其中空白组用正常细胞培养液培养；模型组采用H2O2刺激2 h；各用药组分别加入上述三种浓度的静宁颗粒干预后，再加入H2O2刺激2 h。

1.6 DAPI染色 细胞培养第9天，按照分组方法处理细胞后，0.4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗3 min×2次，DAPI染色5 min，PBS清洗3 min×2次，置荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。

1.7 ROS、MDA、SOD及GSH含量测定 细胞培养第9天，按照分组方法处理细胞后，按试剂盒操作说明检测ROS、MDA、SOD及GSH 的含量。

1.8 Western blot检测Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1、p53、Bax、Bcl-2及Caspase 3蛋白表达 细胞培养第9天，按照分组方法处理细胞后，细胞刮取细胞，加入蛋白裂解液置于冰上30 min，使其充分裂解，离心(4 ℃，10000 r/min)10 min，吸取上清即为蛋白。然后采用BCA法对蛋白定量。95 ℃水浴使蛋白变性后，经 SDS-PAGE蛋白质电泳、转膜、封闭。置于含对应一抗的Blotto中，4 ℃摇动作用过夜，漂洗4次后滴加二抗，室温作用1.5 h。漂洗4次后使用奥德赛仪器进行扫膜[8]。

1.9 统计学方法 用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 原代皮层神经元细胞的形态 原代皮层神经元细胞在培养4 h左右后基本贴壁，此时细胞呈圆形，光晕透亮，有立体感；培养1 d后，部分细胞出现突触，多数以圆形或椭圆形存在；培养至第3天，多数细胞长出突触，密度较之前增大；培养至第9天时，胞体明显增多，立体感增强，突起更长且增粗，并交织成网络，表明原代皮层神经元功能正常(图1)。

A：培养第1天；B：培养第3天；C：培养第9天

2.2 静宁颗粒给药浓度及H2O2造模浓度筛选 根据MTT结果显示，与空白组相比，当静宁颗粒浓度≤0.8 mg/ml时，对原代皮层神经元无细胞毒性；当静宁颗粒浓度为1.6、2.0、2.5 mg/ml时，细胞活力分别为39.05%、15.62%、15.84%，低于空白组(P<0.01)。因此，选取浓度为0.8、0.4、0.2 mg/ml的静宁颗粒溶液作为高中低浓度进行后续研究。

MTT结果可知，当H2O2浓度为50、100 μmol/L时，原代皮层神经元细胞的存活率分别为62%、27%，并且随浓度增大，存活率降低。用50 μmol/L H2O2刺激细胞2 h时，胞体肿胀变圆，立体感变差，光晕变得不明显，突起断裂或消失，有较多细胞碎片，所交织成的网络消失不见。随着H2O2浓度增加，大量细胞死亡。见图2。因此，选取50 μmol/L H2O2刺激细胞2 h作为氧化应激损伤模型的造模条件。

A：对照组；B：50 μmol/L H2O2；C：100 μmol/L H2O2；D：200 μmol/L H2O2；E：400 μmol/L H2O2；F：800 μmol/L H2O2

2.3 DAPI染色结果 由DAPI染色结果可知，静宁颗粒低剂量组、静宁颗粒中剂量组、静宁颗粒高剂量组均能够改善H2O2刺激导致的原代神经元的细胞核固缩以及核形状不规则，并且能够减少凋亡小体的出现频率；另外随着静宁颗粒药物浓度的增加，细胞核固缩和不规则程度降低，凋亡小体出现频率降低，呈现明显剂量依赖关系(图3)。

箭头指向凋亡细胞；A：对照组；B：H2O2模型组；C：静宁颗粒低剂量组；D：静宁颗粒中剂量组；E：静宁颗粒高剂量组

2.4 静宁颗粒预处理对原代皮层神经元ROS、MDA、SOD和GSH含量的影响 见表1。与H2O2造模组相比，当静宁颗粒浓度为0.2、0.4、0.8 mg/ml时，ROS含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；静宁颗粒浓度为0.4、0.8 mg/ml时，MDA含量低于模型组(P<0.05)；与H2O2造模组相比，当静宁颗粒浓度为0.4、0.8 mg/ml时，SOD含量升高，差异有统计学意义(P<0.001)；静宁颗粒浓度为0.4、0.8 mg/ml时，GSH含量高于模型组(P<0.01)。

表1 各组处理对H2O2诱导的原代皮层神经元ROS、MDA、SOD、GSH含量的影响(%)

2.5 静宁颗粒预处理对原代皮层神经元Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1、p53、Bax、Bcl-2及Caspase 3蛋白表达的影响 Western blot分析结果显示，模型组Keap1蛋白表达高于对照组(P<0.01)，当静宁颗粒浓度为0.4、0.8 mg/ml时，Keap1蛋白表达均降低，且具有统计学差异(P<0.05)。与空白组相比，模型组Nrf2蛋白表达降低(P<0.05)。当静宁颗粒浓度为0.4、0.8 mg/ml时，Nrf2蛋白表达高于模型组(P<0.05)。模型组NQO1、HO-1蛋白表达低于对照组(P<0.01)，当静宁颗粒浓度为0.4、0.8 mg/ml时，NQO1蛋白表达均升高，且具有统计学差异(P<0.05)。当静宁颗粒浓度为0.4、0.8 mg/ml时，HO-1蛋白表达高于模型组(P<0.01)。因此，以上结果表明静宁颗粒能够修复H2O2造成的原代皮层神经元的氧化应激损伤，见图4(表2)。

图4 不同浓度静宁颗粒对H2O2诱导的原代皮层

表2 各组处理对原代皮层神经元Keap1、NQO1、Nrf2、HO-1蛋白表达的影响(%)

由静宁颗粒对原代皮层神经元细胞凋亡蛋白的检测结果表明，模型组中促凋亡蛋白p53、Bax、Caspase 3及cleaved-Caspase 3表达明显高于空白组，差异具有统计学意义(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显低于空白组，差异具有统计学意义(P<0.01)。当静宁颗粒浓度为0.8 mg/ml时，p53表达明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。当静宁颗粒浓度为0.4、0.8 mg/ml 时，Bax、Caspase 3及cleaved-Caspase 3蛋白表达明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，Bcl-2表达显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。因此，以上结果表明静宁颗粒能够修复H2O2造成的原代皮层神经元的凋亡损伤，见表3(图5)。

表3 各组处理对原代皮层神经元p53、Bax、Bcl-2、Caspase 3、cleaved-Caspase 3蛋白表达的影响

图5 不同浓度静宁颗粒对H2O2诱导的原代皮层

3 讨 论

ADHD是儿童时期最常见的一种神经行为障碍，严重影响患者的学习、生活和工作质量。中医认为ADHD是一种心肝有余、脾肾不足的本虚标实证，病机为气机紊乱，久而化热，耗伤肝阴，肝阴不足而肝阳易亢，肝经有热，肝火亢盛，火动生风，则出现性情暴躁，多动任性等症状。目前，中医药治疗ADHD多以滋肾平肝、调和阴阳、安神益智、豁痰开窍为主，进而发挥治疗ADHD的作用[9]。静宁颗粒由太子参、熟地黄、五味子、枸杞子、远志、石菖蒲、茯苓共七味药组成，符合元代李东垣所说：“主病之为君，兼见何病，则以佐使药分治之，此制方之要也”的原则。方中太子参性平，味甘微苦，补气润肺、生津健脾，熟地黄味甘微温，补血滋阴、填精生髓共为君药；五味子补肾宁心，枸杞子滋补肝肾、补血安神共为臣药；远志味苦辛，性温，安神益智，石菖蒲开窍豁痰、醒神益智，茯苓味甘淡，性平，健脾益气、安神共为佐使药。诸药合用，治疗气阴两虚证的ADHD。

ADHD大脑皮层是调节躯体运动或者说控制躯体运动的最高级中枢，而ADHD的发生与大脑皮层有关[10-11]。通过神经影像学发现ADHD患者的前额、基底节和胼胝体存在着大脑皮层体积的异常且已有证明前额叶的体积减小与反应机制损伤有关[12-13]。这都与ADHD注意力不集中、多动、冲动性的特征一致。本文选取原代皮层神经元细胞，H2O2造成氧化损伤，从氧化应激方面探讨静宁颗粒治疗ADHD的机制。

Keap1/Nrf2-ARE信号通路是内源性抗氧化应激通路，它能够抵抗各种体内外刺激所导致的氧化应激反应，在机体的防御中发挥重要作用[14-16]。本研究中，模型组Keap1蛋白表达明显升高，而Nrf2蛋白表达明显降低，说明H2O2造模后Keap1表达增加，Nrf2活化被抑制，导致Nrf2激活障碍，说明神经元细胞氧化应激的发生与Keap1/Nrf2信号通路调控异常有关。静宁颗粒给药后Keap1蛋白表达降低，Nrf2的表达升高。说明静宁颗粒给药后能够调控Nrf2的激活，激活的Nrf2与Keap1解离入核，与抗氧化反应元件相结合，进一步引发HO-1、NQO1等蛋白表达发挥其抗氧化应激的作用，从而保护原代神经元细胞免受氧化应激损伤。

线粒体依赖途经诱导的凋亡起始于线粒体，并被内源性ROS调控，引发细胞凋亡[17-18]。已有研究表明，p53能够通过调控Bcl-2、Bax等凋亡相关蛋白引发凋亡[19-20]。另外，抑制凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax的比值被认为是启动细胞凋亡的“分子开关”[21]。由结果可知，H2O2造模后，p53、Bax、Caspase 3、cleaved-Caspase 3蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低。静宁颗粒保护后，p53、Bax、Caspase 3、cleaved-Caspase 3蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高。

本研究表明了静宁颗粒对H2O2所致小鼠原代皮层神经元氧化应激损伤具有保护作用，可改善细胞损伤后形态，该过程与Keap1/Nrf2氧化应激通路和Caspase依赖的线粒体通路有关。多数神经系统疾病与氧化应激损伤有关，该研究为静宁颗粒在神经疾病中的应用开发提供了依据。