许 财，郭晓晓，马 媛，王麒超，孟爱霞，陈 永*

1潍坊医学院生命科学与技术学院；2潍坊医学院基础医学院，潍坊 261000

中药红毛五加皮为五加科植物红毛五加(AcanthopanaxgiraldiiHams)的茎皮，主产于甘肃、宁夏、青海、四川等地，具有祛风湿，强筋骨，活血利水之功效[1]。红毛五加多糖(AcanthopanaxgiraldiiHams polysaccharide)为其有效成分之一，具有抗肿瘤[2]、抗病毒[3]、保肝[4]、免疫调节[5]等药理作用。

巨噬细胞广泛分布于机体不同组织中，不但参与固有免疫反应和适应性免疫，而且是两者间的“桥梁细胞”[6]，活化的巨噬细胞可吞噬外来异物或直接杀死病原体和肿瘤细胞；并可通过释放肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、NO等相关细胞因子参与机体的免疫应答。已有研究表明，中药多糖可以激活巨噬细胞促进TNF-α、IL-6和NO等细胞因子的释放[7]。

本文以课题组前期从红毛五加皮中提取到的多糖单一组分AHP-Ⅲ[8]为研究对象研究其对小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞的活化作用，并尝试探讨其机制。

1 试剂与仪器

1.1 材料与试剂

红毛五加多糖AHP-Ⅲ(由课题组前期制备)；小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7，购于中国科学院细胞库。

DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Gibco公司，批号分别为8119461、1618862)；Mouse IL-6 Uncoated ELISA Kit 和Mouse TNF-αELISA Kit(美国Thermo公司，批号分别为229646-005、228922-007)；总一氧化氮检测试剂盒和CCK-8检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为0827220201019、010919190704)；TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(中国TaKaRa公司，批号：AJF2613A)；NF-κB p65 Rabbit mAb、phospho-NF-κB p65 Rabbit mAb、IKK-β(D30C6)Rabbit mAb、Phospho-IKKα/β(Ser176/180)Rabbit mAb、IκBα(L35A5)Mouse mAb、Phospho-IκBα(Ser32)Rabbit mAb(美国Cell Signaling公司，批号分别为8242、3033、8943、2697、7074、7076、4814、2859)；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器设备

HERACELL 150i 200型CO2细胞培养箱(丹麦Heto公司)；HE LaserJet 1020 plus Epoch超微量分光光度计购于(美国Bio Tek公司)；LightCycler 480 Ⅱ实时荧光定量PCR仪(罗氏公司)；Amersham lmager 600超灵敏数字发光成像仪(Cytiva公司)。

2 实验方法

2.1 细胞培养

RAW 264.7巨噬细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基于CO2培养箱中37 ℃ 5% CO2常规培养，每3天传代1次，传代比例1∶3，传代次数不超过30代。

2.2 吞噬能力检测

采用中性红吞噬法[9]检测巨噬细胞吞噬能力。将细胞按7×104个/孔，接种于96孔板，37 ℃ 5% CO2条件下培养过夜。实验孔中加入不同浓度(25、50、100 μg/mL)AHP-Ⅲ，对照(LPS)孔中加入0.1 μg/mL LPS，空白(blank)孔加入相同体积培养基，37 ℃ 5% CO2培养24 h。每孔加入1%中性红溶液20 μL，继续培养2 h后，PBS洗涤3次，每孔加200 μL中性红检测裂解液，室温摇床上裂解10 min，酶标仪540 nm检测各孔吸光度值。计算吞噬率：吞噬率=(实验组吸光度值/空白组吸光度值)×100%。

2.3 TNF-α、IL-6分泌量检测

按“2.2”的实验分组给药，培养24 h后收集上清，按照Thermo公司ELISA试剂盒说明书，酶标仪测定吸光度(A450 nm)，根据标准曲线计算上清中的IL-6和TNF-α的浓度。

2.4 NO分泌量检测(Griess法)[10]

按“2.2”的试验分组给药，培养24 h后收集上清(60 μL)，按照试剂说明书进行操作，与Griess试剂混合，避光反应10 min，酶标仪540 nm测定吸光度。NO浓度参考NaNO2(2～80 μmol/L)标准曲线计算。

2.5 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)[11]

取对数生长的RAW 264.7细胞调节浓度至7.5×105个/mL，每孔2 mL接种于6孔板中，37 ℃ 5% CO2条件下培养过夜。按“2.2”的实验分组给药，37 ℃ 5% CO2培养24 h。Trizon试剂提取总RNA。利用HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒反转录成cDNA。每样品各取1 μL的cDNA按照TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ说明书进行RT-qPCR反应，所用引物如表1所示。反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s共循环30次，73 ℃终末延伸5 min。程序运行结束后，记录收集Ct值，采用2-△△Ct法计算各组mRNA相对表达量。

表1 RT-qPCR所用引物序列

2.6 免疫印迹实验[12]

取对数生长的RAW 264.7细胞调节浓度至2×106个/mL，每个培养皿(d=60 mm)加入1 mL细胞悬液、4 mL 10%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃ 5% CO2培养过夜，按“2.2”的实验分组给药后继续培养1 h。加入RIPA细胞裂解液，反复吹打细胞直至细胞完全裂解，离心收集上清，提取蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。每组各取40 μg蛋白上样，于10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白(浓缩胶电压80 V，30 min；分离胶电压100 V，60 min)。将分离后的蛋白转移(100 mA，60 min)至PVDF膜。加入5%脱脂奶粉于摇床上室温封闭1 h，再分别加入一抗抗体(体积稀释比例均为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。次日以TBST洗膜3次，每次10 min；之后加入HRP标记的二抗(体积稀释比例为1∶1 000)，于室温反应1 h；用TBST洗膜3次，每次10 min。按ECL试剂盒说明书进行曝光显影。

2.7 统计学分析

实验数据均采用SPSS 21.0软件进行统计分析。组间差异用t检验进行，P<0.05表示有统计学显著性差异。

3 实验结果

3.1 AHP-Ⅲ对RAW 264.7细胞免疫活性影响检测

3.1.1 AHP-Ⅲ对巨噬细胞RAW 264.7吞噬能力的影响

与空白组相比，AHP-Ⅲ在实验浓度范围内(25～100 μg/mL)均可增强RAW 264.7细胞的吞噬能力(P<0.05)，如图1所示。

图1 AHP-Ⅲ对RAW 264.7细胞吞噬能力的影响Fig.1 Effect of AHP-Ⅲ on the phagocytosis of RAW 264.7 cells注：与空白组相比，*P<0.05。Note:Compared with blank group,*P<0.05.

3.1.2 AHP-Ⅲ对巨噬细胞RAW 264.7细胞因子分泌的影响

如图2所示，与空白组相比，AHP-Ⅲ在25～100 μg/mL浓度范围内，可显著促进RAW 264.7细胞分泌TNF-α(P<0.05或P<0.001)，并呈剂量依赖性。同时，AHP-Ⅲ高剂量实验组可促进RAW 264.7细胞分泌IL-6(P<0.05)。

图2 AHP-Ⅲ对RAW 264.7细胞释放TNF-α、IL-6的影响Fig.2 Effect of AHP-III on the release of TNF-α and IL-6 from RAW 264.7 cells注：与空白组相比，*P<0.05，**P<0.001。Note:Compared with blank group,*P<0.05,**P<0.001.

3.1.3 AHP-Ⅲ对RAW 264.7 NO生成的影响

如图3所示，AHP-Ⅲ在3个不同浓度的实验组均能显著增加RAW 264.7细胞NO的释放(P<0.05或P<0.001)，中、高剂量组释放量高于低剂量组，且AHP-Ⅲ浓度为50 μg/mL时，RAW 264.7的NO释放量最高。

图3 HP-Ⅲ对RAW 264.7细胞释放NO的影响Fig.3 Effect of HP-III on NO release from RAW 264.7 cells注：与空白组相比，*P<0.05，**P<0.001。Note:Compared with blank group,*P<0.05,**P<0.001.

3.1.4 AHP-Ⅲ对巨噬细胞RAW 264.7中TNF-α、IL-6、iNOS mRNA表达的影响

TNF-α、IL-6和iNOS基因相对表达水平的结果显示，与空白组相比，AHP-Ⅲ的25 μg/mL浓度组TNF-α基因表达水平显著升高(P<0.05)，50 μg/mL和100 μg/mL浓度组TNF-α基因表达水平极显著升高(P<0.001)，如图4A所示。如图4B所示，AHP-Ⅲ的50 μg/mL和100 μg/mL浓度组IL-6基因表达水平显著升高(P<0.05或P<0.001)。如图4C所示，AHP-Ⅲ的25 μg/mL浓度组iNOS基因表达水平显著升高(P<0.05)，50 μg/mL和100 μg/mL浓度组iNOS基因表达水平极显著升高(P<0.001)。并且，与空白组相比AHP-Ⅲ对巨噬细胞TNF-α、IL-6和iNOS基因相对表达量的影响具有明显的剂量依赖性。

图4 AHP-Ⅲ对RAW 264.7细胞TNF-α、IL-6和iNOS mRNA表达水平的影响Fig.4 Effect of AHP-III on the expression levels of TNF-α,IL-6 and iNOS mRNA in RAW 264.7 cells注：与空白组相比，*P<0.05，**P<0.001。Note:Compared with blank group,*P<0.05,**P<0.001.

3.1.5 AHP-Ⅲ对巨噬细胞RAW 264.7 NF-κB信号通路相关蛋白表达影响的测定

如图5所示，与空白组相比，AHP-Ⅲ实验组中的磷酸化p65(p-p65)/p65蛋白表达水平比值升高，当AHP-Ⅲ给药浓度为50 μg/mL时达到最高，且具有显著性差异(P<0.05)(见图5B)；磷酸化IKKβ(p-IKKβ)/IKKβ蛋白表达水平比值在实验浓度范围内上升并具有显著性差异(P<0.001)(见图5C)。磷酸化IκBα(p-IκBα)/IκBα蛋白表达水平在实验浓度范围内均高于空白组，且具有显著性差异，但没有剂量依赖性(见图5D)。以上结果表明AHP-Ⅲ作用RAW 264.7细胞时，细胞内的NF-κB通路会被激活。

图5 AHP-Ⅲ对RAW 264.7细胞NF-κB相关蛋白表达的影响Fig.5 Effect of AHP-Ⅲ on expression of NF-κB related protein in RAW 264.7 cells注：与空白组相比，*P<0.05，**P<0.001。Note:Compared with blank group,*P<0.05,**P<0.001.

4 讨论与结论

免疫反应通过“识别”和排除抗原性异物，维持机体内环境的平衡和稳定。炎症是由剧烈的免疫反应引起[13]，其特征是协调激活各种信号通路，调节组织细胞和血液白细胞中促炎和抗炎介质的表达；有效的炎症反应依赖于免疫系统、血管系统和组织之间复杂的细胞和分子相互作用，可提高机体免疫调节功能，例如植物多糖等可激活巨噬细胞增强其吞噬杀伤功能，以及释放相关的细胞因子达到免疫调节作用[14,15]。

巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，在机体中发挥抵抗感染、保持自身内环境稳定以及免疫监视的作用，活化后的巨噬细胞能够产生免疫应答和炎症有关的生物活性分子，如NO、白介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)等。已有报道表明巨噬细胞能够作为多糖的靶细胞，通常作为理想的细胞模型来评估多糖的免疫调节活性[16]。Liu等[17]研究发现西洋参花多糖可通过增强巨噬细胞吞噬能力以及释放免疫因子等方面增强巨噬细胞免疫活性。另外，灵芝多糖和猪苓多糖经研究发现对巨噬细胞同样具有激活作用[18]。

目前关于多糖生物活性的研究多针对粗多糖，其成分复杂，不便于阐明多糖作用机制[19]。课题组前期从红毛五加粗多糖分离纯化得到3个单一组分[20]，本研究在课题组前期研究的基础上，探讨红毛五加多糖AHP-Ⅲ对小鼠巨噬细胞RAW 264.7的激活作用及机制。

巨噬细胞的吞噬作用是先天性免疫的基本防御机制，中性红实验表明AHP-Ⅲ可以增强RAW 264.7细胞的吞噬能力，且在实验浓度范围内具有显著性差异。NO是由巨噬细胞分泌产生的一种信号分子，在机体免疫调节和炎症反应方面起重要作用[21]，由3种NO合成酶催化产生，其中一些外来刺激如干扰素类、炎症因子类(TNF-α、IL-6)等都可激活诱导型NO合酶(iNOS)[22,23]。IL-6和TNF-α常被用作促炎细胞因子系统激活的标志[24]，RT-qPCR和ELISA实验表明，AHP-Ⅲ通过提高TNF-α、IL-6基因表达水平，增加该细胞因子释放量，其中ELISA实验中空白组TNF-α细胞因子的释放量低于标准曲线最低阈值，释放量较少，计算结果为0；RT-qPCR实验表明iNOS基因表达水平随着给药剂量增大而升高，且与空白组相比具有显著性差异；同时，通过Griess试验可知，与空白组相比给药组NO分泌量显著增加。上述实验结果表明AHP-Ⅲ可通过提高细胞因子基因的表达进而促进细胞因子释放，起到免疫调节作用。

NF-κB长期以来一直被认为是一种典型的促炎信号通路，很大程度上基于促白细胞介素等促炎细胞因子和肿瘤坏死因子激活，可通过巨噬细胞介导炎症反应[25,26]。RAW 264.7巨噬细胞受TNF-α和IL-6等炎症因子刺激后激活NF-κB信号通路中的IKK激酶，磷酸化的IKK可使IκBa磷酸化并被降解，释放NF-κB二聚体，提高NF-κB信号通路相关蛋白磷酸化水平[27]。Western blot实验结果表明，AHP-Ⅲ刺激RAW 264.7巨噬细胞后，NF-κB中的p65、IKKβ和IκBα磷酸化水平明显升高。证实AHP-Ⅲ可能通过诱导NF-κB中p65和IKKβ磷酸化来激活NF-κB信号通路，进而刺激RAW 264.7巨噬细胞活化。

综上所述，AHP-Ⅲ试验组相较于空白组RAW 264.7巨噬细胞吞噬能力显著提升，细胞因子NO、IL-6和TNF-α释放量和基因表达水平明显上调，且具有一定的剂量依赖性；同时NF-κB信号通路中的p65、IKKβ磷酸化水平明显提高。由此可知AHP-Ⅲ可能通过激活NF-κB信号通路达到免疫调节作用，为红毛五加多糖的进一步开发利用提供理论依据。