韩大勇 赵旭庭 周春宝 陈章言 倪黎刚

摘    要：為研究姜曲海猪保种群线粒体DNA遗传多样性及种质特性，选取姜曲海猪保种群中58个体进行mtDNA D-loop高变区序列扩增测序，获得的长度为427 bp有效序列基因片段，然后对有效序列遗传多样性进行了分析。结果表明：（1）姜曲海猪的mtDNA D-loop高变区扩增测序的有效序列基因片段中，碱基A+T含量为63.2%，G+C含量为36.8%，碱基A+T含量明显高于G+C含量;（2）在58个序列中共有15个变异位点，其中T/C转换10次、G/A转换3次、A/T颠换1次、C/A颠换1次;（3）检测出单倍型3个，总的单倍型多样性和核苷酸多样性指数分别为0.686和0.005 2，表明姜曲海猪种群遗传多样性偏低，姜曲海猪保种群母系来源单一;（4）单倍型间遗传距离计算结果表明，种群内3个单倍型之间的平均遗传距离在0.003～0.005之间，单倍体间的遗传距离较近，表明保种群近交的情况比较严重。

关键词：线粒体DNA控制区;遗传多样性;种质资源保护;姜曲海猪

中图分类号：S828.8         文献标识码：A            DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.01.005

Genetic Diversity Analysis of mtDNA Partial D-loop Sequences in Jiangquhai Pig

HAN Dayong1， ZHAO Xuting1， ZHOU Chunbao1， CHEN Zhangyan2， NI Ligang1

（1.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College，Taizhou，Jiangsu 225300， China;2. Jiangsu Jiangquhai Breeding Pig Farm， Taizhou，Jiangsu 225300， China）

Abstract： In order to study the genetic diversity and germplasm characteristics of mitochondrial DNA in Jiangquhai pig conservation population， fifty-eight individuals in Jiangquhai maintenance breeding population were selected for mtDNA analysis D-loop hypervariable region sequence amplification and sequencing and an effective sequence gene fragment of 427 bp was obtained， then the genetic diversity of effective sequences was analyzed. The results showed that the content of A+T （63.2%） was significantly higher than that of G+C（36.8%） in the effective sequence gene fragment of mtDNA of Jiangquhai pig amplification and sequencing of D-loop hypervariable region. There were 15 variation sites in 58 sequences， including T/C conversion （10）， G/A conversion （3）， A/T transversion（1） and C/A transversion （1）. Three haplotypes were detected， and the total haplotype diversity and nucleotide diversity index were 0.686 and 0.005 2 respectively， indicating that the genetic diversity of Jiangquhai pig population was low， and the maternal source of Jiangquhai pig conservation population was single; Calculation of genetic distance between haplotypes showed that the average genetic distance among the three haplotypes in the population was 0.003-0.005， and the genetic distance between haplotypes was close， indicating that the inbreeding of the conservation population was serious.

Key words： mitochondrial DNA control region; genetic diversity; germplasm conservation; Jiangquhai pig

收稿日期：2021-07-04

基金项目：国家发展和改革委员会生物育种能力建设与产业化专项项目（发改办高技 [2014]2573号）; 姜曲海猪保种群mtDNA D-loop序列遗传多样性分析（YB1201）

作者简介： 韩大勇（1980—），男，甘肃民乐人，副教授，硕士，主要从事畜禽遗传资源保护与开发利用方面研究。

通讯作者简介：赵旭庭（1966—），男，江苏靖江人，教授，硕士，主要从事猪品种资源开发与保护方面研究。

姜曲海猪是江苏省的一个历史悠久的优良地方猪种，主产于江苏省海安、泰州市姜堰区一带，中心产区位于泰州、南通、扬州三市，而以姜埝、曲塘、海安镇为主要集散地，因而得名。但姜曲海猪生长速度慢，瘦肉率低[1]，自我国从国外引进瘦肉型猪品种并广泛推广后，姜曲海猪种群数量逐年减少，目前在江苏姜曲海种猪场存栏150头左右种猪，数量较少，已进入国家地方品种资源保护名录。线粒体是动物细胞中重要的细胞器，线粒体 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是动物体细胞核外遗传物质的重要载体，其分子量小，大小为16.5 kb左右，呈共价闭合环状结构，具有进化速度快、遗传上自主性及严格的母系遗传等特性[2]。研究表明线粒体 DNA的变异主要来源于突变，此特点对揭示动物群体的遗传转化关系比较准确，在家畜种群分类、群体遗传结构分析、经济性状的研究方面应用广泛[3-4]。D-loop为mtDNA 的控制区，为非编码区，是mtDNA 分子内的高变区，进化过程中，D-loop 的碱基替换率是mtDNA 分子的其他区域的5～10 倍，通过对mtDNA的D-loop区域序列的变异情况进行检测，分析该区域的碱基转换、颠换、缺失、插入的情况，可以了解畜禽种内和近缘种间亲缘关系，同时分析种群的遗传多样性[5-11]。

目前，有关姜曲海猪的线粒体DNA的遗传特性规律研究少见报导。本研究以江苏姜曲海猪保种场保存的姜曲海猪核心种群猪只为主要对象，分析姜曲海猪保种群mtDNA D-loop区多态位点的遗传变异情况，评价姜曲海猪群体种质资源特性及其遗传多样性，为姜曲海猪品种资源保护与开发利用提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 样品采集

在江苏姜曲海种猪场采集58头保种群姜曲海猪耳样，超低温冰箱冷冻保存备用。

1.2 DNA提取扩增及测序

使用组织基因组DNA抽提试剂盒（天根生化科技有限公司）提取的58头姜曲海猪基因组DNA。在NCBI数据库下载猪的线粒体序列（AJ002189），在待扩增区域两端选择保守区，利用Primer5软件中设计如下引物：L99：5’-CCCAAAGCTGAAATTCTAA

CTAAA-3’和H（451）：5’-GGTGAGATGGCCCTGAA

GTAAG-3’，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

PCR反应体系：10×Buffer2.5 μL，dNTP （10 mmol·L-1） 2 μL，上下游引物（ 10 μmol·L-1）各2 μL，Taq DNA聚合酶0.21 μL，模板DNA100 ng，加双蒸水至25 μL 。

PCR条件：95 ℃预变性5 min，33个循环（每个循环包括94 ℃变性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 s），72 ℃继续延伸10 min，PCR产物低温保存，送南京金斯瑞生物科技有限公司进行经回收、纯化、测序。

1.3 数据处理

使用DNASTAR软件包中的Editseq 5.0程序将PCR扩增序列测序结果进行处理，然后利用Clustal（version：1.2.1）进行比对，并将比对结果进行手动校对，删除序列间隙和两端的不确定碱基[12]。应用DNASP 5.10分析线粒体DNA序列单倍型多样性（h）和核苷酸多样性（π）[13]，用MEGA6软件计算变异位点的确定及单倍型间的遗传距离（p-距离模式）[14]。

2 结果与分析

2.1 姜曲海猪mtDNA D-loop序列变异情况

用 2 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物，发现1条450 bp左右的特异性条带，PCR 产物经回收纯化后测序，获得了58个样本的扩增序列，去除引物序列及两端测序可能不准确区域，获得的有效序列基因片段长度为427 bp （AJ002189的第15 425～15 851 bp）。在姜曲海猪的mtDNA D-loop高变区扩增测序的有效序列基因片段中，碱基A+T含量为63.2%，G+C含量为36.8%，A+T含量明显高于G+C含量，与以前的研究报道线粒体控制区富含AT的结论相一致。利用Clustal软件进行同源序列比对，结果发现在该检测区段，58个姜曲海猪在该区段得到3种单倍型，3个单倍型个体数相差不大，3个单倍体中有15个多态位点（表1），表明姜曲海猪保种群单倍型数量少，种群的遗传多样性不高;多态位点中有13个单一性可变位点、2个简约性变异位点，多态性位点比例为 3.51%;序列中转换频率较高，颠换发生的较少，序列中无碱基缺失和插入;其中有10次T/C转换，3次G/A转换、1次A/T颠换、1次C/A颠换，转换和颠换之比为6.5∶1，显示出强烈的转换偏倚现象，这是动物 mtDNA 的一个显著特征。

2.2 种群遗传多样性

应用DNASP 5.10软件对测序结果进行核苷酸多態性分析，结果表明姜曲海猪58个样本单倍型数量为3，单倍型多样度为0.686±0.018，核苷酸多样度（π）为 0.005 2±0.000 85。单倍型多样性指数及核苷酸多样性分析结果说明姜曲海猪种群遗传多样性较低。 对姜曲海猪 mtDNA D-loop 区序列进行中性检验，Tajima’s D值为-0.927 55，差异不显著（P>0.05），符合中性突变。

2.3 种内遗传距离

对样本进行基于kimura双参数的遗传距离计算，由表2看出，58个个体的3个单倍型之间的平均遗传距离为0.003～0.005，其中单倍型H3与其他2个单倍型之间的距离较大，而单倍型H1、H2之间的距离比较小，总体分析，3个单倍型之间的距离不大。3 结论与讨论

3.1 姜曲海猪线粒体DNA控制区的序列变异

在58个姜曲海猪个体的 mtDNA D-loop高变区427 bp的比对序列中，共得到15个变异位点和3种单倍型，多态性位点比例为3.51%。亐开兴等[15]研究表明云南保山猪19个个体的mtDNA D-loop高变区中发现8个多态位点，多态位点比例为1.83%;而刘益平等[14]研究表明苏钟猪21个个体中发现多态位点16个，多态位点比例3.62%;彭红元等[17]研究表明陆川猪在74个个体中检测到7个单倍体，共发现20个变异位点。本研究中发现姜曲海猪的线粒体单倍型和多态位点相对较少，虽然3个单倍体的个体数量基本均衡，但还是能反映出姜曲海保种群母系来源较少，群体多样性较低的特征。DNA 序列中有转换和颠换2种形式的碱基替换，多数的研究结果认为，线粒体基因组DNA发生转换的频率要远高于颠换。本研究中，姜曲海猪线粒体DNA序列发生13次碱基转换，2次碱基颠换，转换次数显著高于颠换，这与其他物种有一致的结果[15]。

3.2 姜曲海猪的遗传多样性

衡量一个品种（群体）mt DNA变异程度的两个重要指标是单倍型多样度（Hd）和核苷酸多样度（Pi），单倍型多样度是指样本中随机抽取到2个不同单倍型的频率、核苷酸多样度是指给定群体内随机选取的mtDNA 序列间的平均每个位点的核苷酸差异数目[19]。Hd和Pi值越大，群体的多态程度越高，其遗传多样性越丰富[20]。本研究中，姜曲海猪的核苷酸多样性指数和单倍型多样性指数分别为0.005 2和0.686，核苷酸多样性指数较低，单倍型多样性指数较高，分析其原因可能是受种群的数量对该猪遗传多样性的影响，虽然通过碱基突变积累了比较好的单倍型多态性，但对核苷酸序列的多样化积累效果较少。因此姜曲海猪今后的保种工作的重点应放在提高姜曲海群体核苷酸多样性方面。

3.3 姜曲海猪群体内3个单倍型之间遗传距离

利用线粒体D-loop区进行的分子遗传距离分析是基于母系起源方面的，有别于其他技术方法计算出的遗传距离。彭红元等[16]研究陆川猪种群内遗传距离在0.003～0.005之间，各种群间的遗传差异很小;丁玫等[18]研究白洗猪各单倍型之间遗传距离变化范围在0.003～0.007，各个单倍型之间的距离总也不大。本研究从线粒体层面计算的姜曲海猪各单倍型之间的遗传距离在0.003～0.005之间，各单倍型之间的遗传距离较小。分析产生这种结果的原因主要是姜曲海猪种群长期独立在保种场内进行人工选择和群内繁殖，几乎没有与场外的交流，造成各单倍型之间的遗传距离交小，遗传多样度不高。因此必须对姜曲海猪的保种方案进行优化和完善，提高保种群遗传多样性。

3.4 姜曲海猪的种质资源保护

姜曲海长期保存在一个相对闭锁的保种场，近交繁殖。但受保种经费、技术等因素的影响，姜曲海种群数量较小，小群体繁殖所导致基因丢失和遗传漂变，进而造成姜曲海猪保种种群的遗传多样性较贫乏，种群的延续能力降低。因此姜曲海豬保种过程中，要加强姜曲海遗传多样性的研究，通过其他技术方法进行主要性状的遗传标记研究，建立种群的遗传谱系，较准确的进行个体识别，在选种选配过程中，让不同单倍体群间进行配种，促进种群间基因交流，提高种群遗传多样性。

参考文献：

[1] 朱荣生. 姜曲海瘦肉型品种猪零世代早期性发育的研究[D]. 扬州： 扬州大学， 2003.

[2] 孙俊丽， 张冰， 马青艳， 等. 陆川猪mtDNA D-loop序列遗传多样性分析[J]. 中国畜牧兽医， 2010， 37（6）： 122-125.

[3] ANDERSON S， BANKIER A T， BARRELL B G， et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome[J]. Nature， 1981， 290（586）： 457-465.

[4] PENG R， ZENG B， MENG X X， et al. The complete mitochondrial genome and phylogenetic analysis of the giant panda （Ailuropoda melanoleuca）[J]. Gene， 2007， 397（1/2）： 76-83.

[5] 张亚平， 施立明. 动物线粒体DNA多态性的研究概况[J]. 动物学研究， 1992， 13（3）： 289-298.

[6] 霍俊宏， 马月辉， 武艳平， 等. 线粒体DNA（mtDNA）的研究进展及其在绵山羊品种资源保存利用中的应用现状[J]. 现代畜牧兽医， 2005（2）： 16-18.

[7] 崔奎青. 线粒体DNA在家畜遗传多样性研究中的应用[J]. 中国畜牧兽医， 2008， 35（6）： 59-63.

[8] 周慧， 李迪强， 张于光， 等. 藏羚羊mtDNA D-loop区遗传多样性研究[J]. 遗传， 2006， 28（3）： 299-305.

[9] 徐盼， 唐子雪， 何鑫鑫， 等. 姜曲海猪和苏姜猪IGF2、MUC13、PHKG1、RYR1和VRTN基因主效位点的遗传变异分析[J]. 江西农业大学学报， 2019， 41（5）： 969-975.

[10] 国家畜禽遗传资源委员会组. 中国畜禽遗传资源志-猪志[M]. 北京： 中国农业出版社， 2011： 64.

[11] SAMBROOK J， RUSSELL D W. Molecular cloning： a Laboratory Manual[M]. 3rd Edition， New YorK： Cold Spring Harbor Press， 2001.

[12] THOMPSON J D， GIBSON T J， PLEWNIAK F， et al. The CLUSTAL X windows interface： flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research， 1997， 25（24）： 4876-4882.

[13] ROZAS J， SANCHEZ-DELBARRIO J C， MESSEGUER X， et al. DnaSP， DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods[J]. Bioinformatics， 2003， 19（18）： 2496-2497.

[14] KUMAR S， TAMURA K， NEI M. MEGA3： integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment[J]. Briefings in Bioinformatics， 2004， 5（2）： 150-163.

[15] 亐開兴， 连林生， 聂龙， 等. 云南保山猪线粒体DNA D-loop区序列初步分析[J]. 遗传， 2003， 25（5）： 526-528.

[16] 刘益平， 邢光东， 陈仕毅， 等. 苏钟猪和太湖猪的线粒体D环部分序列比较分析[J]. 江苏农业学报， 2007， 23（3）： 200-203.

[17] 彭红元， 廖龙， 黄业， 等. 陆川猪种群线粒体DNA遗传多样性研究[J]. 广东农业科学， 2012（2）： 91-94.

[18] 丁玫， 韦雄， 密国辉， 等. 白洗猪线粒体DNA控制区分子遗传变异分析[J]. 中国畜牧杂志， 2014， 50（5）： 1-5.

[19] 欧阳依娜， 江炎庭， 孙利民， 等. 10个云南地方猪种微卫星遗传多样性分析[J]. 中国畜牧兽医， 2018， 45（4）： 992-1001.

[20] 陈祥， 丁玫， 孙鹃， 等. 贵州3个地方猪种的mtDNA D-loop序列遗传多样性分析[J]. 畜牧与兽医， 2015， 47（5）： 55-59.