曹磊 张成立 侯颖

肺癌是起源于肺部支气管黏膜、腺体的恶性肿瘤，具有较高的发病率及死亡率[1]。肺癌细胞的异常增殖及侵袭活动对肺癌的发展具有促进作用。微小RNA(microRNA，miR)是一类内源性非编码RNA，其失调与肺癌细胞的增殖、侵袭活动密切相关[2]。有研究表明，miR-367-3p在非小细胞肺癌细胞中表达显著降低，可调节癌细胞上皮间质转化过程[3]。细胞周期素D2重组蛋白(recombinant cyclin D2 protein，CCND2)是D型细胞周期蛋白cyclin蛋白家族成员，与肺癌细胞的增殖、转移活动联系密切[4-5]，抑制CCND2表达可降低非小细胞肺癌细胞的增殖和转移能力[5]。靶基因预测显示,miR-367-3p与CCND2存在结合位点。本研究探究miR-367-3p调控CCND2表达对肺癌细胞增殖、迁移的影响。

材料与方法

一、材料

人肺癌细胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647、人正常肺细胞HLF-a于武汉普诺赛生命科技有限公司。

二、方法

1.细胞培养：将人肺癌细胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647、人正常肺细胞HLF-a接种到RPMI1640培养基(含10%FBS)于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每2天更换1次新鲜培养基。

2.肺癌细胞中miR-367-3p表达水平的测定：收集对数生长期人肺癌细胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647、人正常肺细胞HLF-a，提取细胞总DNA，经逆转录合成cDNA，以U6作为内参，进行qRT-PCR扩增。miR-367-3p引物序列5'-3'：上游AGTGCAGGGTCCGAGGTATT，下游CGACGAATTGCACTTTAGC；U6引物序列5'-3'：上游CGAGCACAGAATCGCTTCA，下游CTCGCTTCGGCAGCACATAT。根据2-△△CT算法分析miR-367-3p相对表达水平，实验重复3次。

3.细胞分组及转染：收集人肺癌细胞Calu，分为对照组(正常培养)、miR-367-3p NC组(转染miR-367-3p阴性对照)、miR-367-3p mimic组(转染miR-367-3p模拟物)、miR-367-3p mimic+pc-CCND2组(共转染miR-367-3p模拟物和pc-CCND2)。使用EntransterTM-R4000转染试剂对各组细胞进行相应转染。

4.肺癌细胞Calu的细胞活力测定：将Calu细胞按照1 500个/孔接种于96孔板，培养24 小时后加入CCK-8试剂，继续培养4小时后，全自动酶标仪测定各孔吸光度值，按照公式计算各组Calu细胞活力。细胞活力(%)=(A测定-A空白)/(A对照-A空白)×100%。

5.肺癌细胞Calu凋亡情况测定：调整Calu细胞浓度为1×106个/ml，取100 μl置于流式管中，依次加入5 μl AnnexinV/Alexa Fluor、10 μl碘化丙啶(PI，20 μg/ml)溶液，混匀、避光室温孵育15 分钟后加入400 μl的PBS缓冲液，于流式细胞仪中检测Calu细胞凋亡情况。

6.肺癌细胞Calu侵袭、迁移能力测定：调整Calu细胞浓度为1×105个/ml，在24孔板中放入铺设好Matrigel胶的Transwell小室，取200 μl各组Calu细胞悬液添加至上室，取适量含20%FBS的RPMI1640培养液于下室，培养24 小时，PBS缓冲液冲去上室残留细胞后用多聚甲醛固定(20 分钟)，结晶紫染色、干燥，显微镜拍照并计数侵袭细胞数。将Calu细胞接种于6孔板并培养至细胞融合率达到90%，用枪头在6孔板底部作划痕，培养24小时，显微镜下观察并分析细胞迁移能力，计算划痕愈合率。划痕愈合率(%)=(0小时划痕宽度-24小时划痕宽度)/0小时划痕宽度×100%。

7.肺癌细胞Calu中CCND2、凋亡、侵袭相关蛋白测定：用高效RIPA裂解液提取Calu细胞中总蛋白质，用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质含量，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭(1 小时)后，加入兔源CCDN2、Caspase-3、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、GAPDH一抗，低温孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，室温孵育1 小时，显色、曝光、凝胶成像仪观察并分析条带。

8.miR-367-3p与CCND2靶向关系验证：Targetscan数据库查询miR-367-3p和CCDN2结合位点，构建突变型(CCDN2-MUT)、野生型(CCDN2-WT)荧光素酶表达载体，将CCDN2-MUT、CCDN2-WT分别与miR-367-3p mimic NC、miR-367-3p mimic共转染至Calu细胞中，培养24 小时后测定各组Calu细胞的相对荧光素酶活性，实验重复3次。

三、统计学分析

结 果

1.各细胞中miR-367-3p表达水平比较：与人正常肺细胞HLF-a相比，人肺癌细胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647中miR-367-3p表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。其中，Calu细胞中miR-367-3p表达相对较低(表1)，因此选取Calu细胞用于后续研究。

表1 各细胞中miR-367-3p表达水平比较

2.各组肺癌细胞Calu中miR-367-3p、CCND2表达水平比较：与对照组比较，miR-367-3p NC组miR-367-3p、CCND2差异无统计学意义(P>0.05)，miR-367-3p mimic组Calu细胞中miR-367-3p表达显著升高，CCND2蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与miR-367-3p mimic组相比，miR-367-3p mimic+pc-CCND2组Calu细胞中CCND2蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组Calu细胞中miR-367-3p及CCND2表达水平比较

3.各组肺癌细胞Calu细胞活力比较：与对照组比较，miR-367-3p NC组Calu细胞活力差异无统计学意义(P>0.05)，miR-367-3p mimic组Calu细胞活力显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与miR-367-3p mimic组比较，miR-367-3p mimic+ pc-CCND2组Calu细胞活力显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组Calu细胞的细胞活力比较

4.各组肺癌细胞Calu凋亡情况比较：与对照组比较，miR-367-3p NC组Calu细胞凋亡率、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，miR-367-3p mimic组Calu细胞凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表达显著升高，Bcl-2蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与miR-367-3p mimic组比较，miR-367-3p mimic+pc-CCND2组Calu细胞凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表达显著降低，Bcl-2蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组Calu细胞凋亡情况比较

5.各组肺癌细胞Calu侵袭、迁移情况比较：与对照组相比，miR-367-3p NC组侵袭、迁移能力、MMP-2、MMP-9蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，miR-367-3p mimic组Calu细胞侵袭、迁移能力、MMP-2、MMP-9蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与miR-367-3p mimic组比较，miR-367-3p mimic+pc-CCND2组Calu细胞侵袭、迁移能力、MMP-2、MMP-9蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 各组Calu细胞侵袭、迁移情况比较

6.miR-367-3p与CCND2靶向关系测定：TargetScan数据库结果显示，miR-367-3p在CCND2的3'-UTR区存在相应结合位点(图1)；荧光素酶实验显示，与CCND2 WT+miR-367-3p NC组(1.00±0.08)相比，CCND2 WT+miR-367-3p mimic组Calu细胞荧光素酶活性(0.43±0.07)显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，CCND2 MUT+miR-367-3p NC组(0.99±0.10)及CCND2 MUT+miR-367-3p mimic组(1.01±0.13)差异无统计学意义(P<0.05)。

图1 miR-367-3p和CCND2的3'-UTR区序列相互结合

讨论

目前，肺癌常用的治疗手段有手术切除、放化疗、分子靶向治疗、药物治疗等。肺癌的治疗已取得较大进展，但由于肺癌就诊时多为晚期，大多数病人的生存质量及预后仍不理想[6-7]。miRNA是近年来发现的参与肺癌等多种恶性肿瘤发生及发展的内源性非编码单链RNA，主要通过与靶基因的3'-UTR区配对来调节靶基因的表达，进而发挥相应的促癌、抑癌作用[2]。miR-367-3p是miRNA302-367家族成员，近年来的研究发现，miR-367-3p与肺癌等多种肿瘤细胞的增殖、迁移活动联系密切[8]，万亮[3]研究发现，miR-367-3p在非小细胞肺癌细胞中表达低于正常肺上皮细胞，Yu等[9]研究发现，提高miR-367-3p的表达可显著抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和迁移。本研究结果显示，人肺癌细胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647中miR-367-3p表达水平显著低于人正常肺细胞HLF-a，其中Calu细胞中miR-367-3p表达相对较低，因此选取Calu细胞用于后续转染实验。转染实验结果显示，miR-367-3p NC组与对照组相比miR-367-3p及CCND2蛋白表达大致相同，miR-367-3p mimic组miR-367-3p表达显著高于对照组，miR-367-3p mimic+pc-CCND2组Calu细胞中CCND2蛋白表达显著高于对照组，提示实验转染效果较好。

恶性增殖、侵袭、转移是恶性肿瘤导致病人分期较高、预后较差、死亡率高的主要原因，肿瘤的恶性程度越大，细胞的侵袭、转移能力越强，邻近的正常组织越易被侵犯，最终导致肿瘤面积扩大[10]。因此，探究miR-367-3p对肺癌细胞增殖、迁移能力的影响具有重要意义。Caspase-3、Bax为重要的促凋亡因子，Bax主要通过增强Caspase-3水平发挥作用，Bcl-2是重要的抗凋亡因子，具有阻止细胞凋亡的作用，测定细胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平可间接反映细胞的凋亡能力[11]。MMP-2、MMP-9与肿瘤细胞的侵袭、迁移活动联系密切，是MMPs家族成员，测定细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达水平可反映细胞的侵袭、迁移能力[12]。本研究结果显示，提高miR-367-3p表达，可显著降低Calu细胞的细胞活力及侵袭、迁移能力，降低细胞中MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表达，提高细胞凋亡率及细胞中Caspase-3、Bax蛋白表达水平，提示miR-367-3p高表达可显著降低肺癌细胞Calu的增殖及迁移能力，并促进其凋亡，但其机制仍不清晰。

CCND2是D型细胞周期蛋白cyclin蛋白家族成员，与肺癌等肿瘤细胞的增殖、转移活动联系密切。Jin等[13]研究发现，上调CCND2表达可促进非小细胞肺癌的发生及发展。多项研究表明，miRNA可靶向调节CCND2参与非小细胞肺癌的生长和转移过程。Yao等[14]研究发现，miR-671-3p可靶向抑制CCND2抑制非小细胞肺癌的发展。He等[15]研究发现，miR-4317可靶向抑制CCND2抑制非小细胞肺癌的迁移及侵袭，提高CCND2表达后可减弱miR-4317的抑制作用。Targetscan预测结果显示miR-367-3p与CCND2的3'-UTR区存在相应的结合位点，荧光素酶活性实验结果显示miR-367-3p过表达能显著下调野生型CCND2-3'UTR荧光素酶活性，表明miR-367-3p可直接靶向调节CCND2的表达，并且，CCND2过表达可逆转miR-367-3p过表达对Calu细胞活力、侵袭、迁移能力的抑制作用。提示miR-367-3p抑制肺癌细胞Calu的增殖、迁移能力可能是通过抑制CCND2表达实现的。

综上所述，miR-367-3p过表达可抑制肺癌细胞Calu的增殖、迁移能力，可能是通过靶向抑制CCND2实现的。本研究存在不足之处，由于条件及时间限制，未做动物实验进一步验证研究结果。