邱娟娟，李玉春，邱 阳，郭 莉，刘越坚，万嘉嘉，熊永建，吴国锴，郭慧淑

（大连医科大学附属第一医院中心实验室，辽宁 大连 116011）

功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）是临床常见的胃肠道紊乱的功能性疾病[1]。功能性消化不良发病率高，但病因病机未完全明确。功能性消化不良尽管不会危及生命安全，但是严重影响生活质量。胃肠动力障碍是FD 主要的病理生理学基础。四磨汤是治疗功能性消化不良的常用中药方剂[2]。本实验观察功能性消化不良模型大鼠胃RhoA 及ROCK 表达的变化，初步探讨RhoA 及ROCK 与功能性消化不良发病机制的关系及四磨汤干预作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性SD 大鼠，体质量（200 ± 20）g，清洁级；出生7 日SD 乳鼠，清洁级。大鼠与乳鼠均购于大连医科大学SPF 动物中心。

1.1.2 主要试剂及仪器 Y27632（Selleck）；四磨汤口服液（湖南汉森制药股份有限公司）；碘乙酰胺和蔗糖（Sigma）；RNA 提取的试剂盒，反转录试剂盒和Real-time PCR 试剂盒（大连宝生物公司）；小平台；Stepone plus 荧光定量PCR 仪（ABI）。生物多道记录仪（BIOPAC）。

1.2 胃平滑肌纵行肌条收缩作用检测 健康雄性SD 大鼠禁食24 h，不禁水。采用10% 水合氯醛（0.3 mL/100 g 体质量）麻醉大鼠，取出全胃。用剪刀沿胃小弯打开胃，用Krebs 液漂洗。去除黏膜层，取平行于胃纵行肌纤维走向的10 mm×1.5 mm 肌条，固定于37℃恒温灌流槽内，Krebs 液灌流，并持续通入95% 氧气和5% 二氧化碳混合氧，利用生物多道记录仪记录胃纵行平滑肌自发性收缩活动。用37 ℃新鲜的Krebs 液持续灌流，孵育60 min 左右，自发性收缩稳定出现后开始实验，加入终浓度1.49×10-4g/mL 四磨汤口服液，描记大鼠胃纵行平滑肌的收缩曲线，洗脱，当肌条稳定的自发性收缩出现后，加入终浓度50 μM的抑制剂Y27632 记录大鼠胃纵行平滑肌的收缩曲线，稳定10 min 后，再次加入终浓度1.49×10-4g/mL 四磨汤口服液，描记大鼠胃纵行平滑肌的收缩曲线变化。观察胃纵行平滑肌收缩的频率变化。

1.3 造模及处理

1.3.1 造模 7 日SD 乳鼠适应性饲养3 d。昼夜各保持12 h，室温22.0～24.0 ℃，保持安静，每笼一母鼠带5只乳鼠。造模开始，正常组：每日每只0.2 mL 的2%蔗糖溶液灌胃，连续灌胃6 d。模型组：每日每只0.2 mL 的0.1% 碘乙酰胺蔗糖溶液灌胃，连续灌胃6 d[3]，同时模型组乳鼠与母鼠每天分离3 h 至3 周龄[4]。3 周龄时，剔除母鼠，分笼，每笼5 只，常规鼠饲料喂养。6 周龄时，模型组大鼠每日22:00－次日7:00置入水环境小平台站立[5]，以剥夺睡眠造成劳倦，14 d 完成站立；正常大鼠组正常喂养。

1.3.2 动物分组及处理 造模完成后分组，分正常组、模型组和四磨汤组。正常组与模型组每天定时2 mL/100（g·d）的生理盐水；四磨汤组每天定时0.09 g/100（g·d）的四磨汤；连续给药7 d。

1.4 模型大鼠监测

1.4.1 旷场实验 大鼠造模后进行旷场试验，保持环境安静，遮光帘隔离实验室，实验前大鼠在实验条件下适应0.5 h，实验时将大鼠放置在旷场中央格，让其先适应3 min，然后进行摄像计时，观察3～5 min 后停止摄像，记录大鼠3 min 内穿格次数（大鼠三爪及以上穿过相邻格子的次数）和站立次数（大鼠两前肢向上抬起离开旷场箱底面或搭在箱侧壁的次数）。每只大鼠记录完毕，用酒精清洗旷场箱并晾干，以免残留动物的信息影响下次结果。实验时保证实验室光照及温度与湿度适宜及隔音，实验在同一时间段进行，以免大鼠活动周期影响实验。

1.4.2 糖水消耗试验 大鼠造模后进行糖水消耗试验。保持环境安静，训练大鼠适应含糖饮水。每笼放置2个水瓶。第1 个24 h，2 瓶均装入1%蔗糖水，第2 个24 h，1 瓶装1%蔗糖水，1 瓶装纯水。随后24 h 禁食禁水后，给予每只大鼠定量的1%蔗糖水1 瓶，纯水1瓶。1 h后，取2瓶水定量测定并计算动物的总液体消耗、糖水消耗、纯水消耗量及糖水偏爱（糖水偏爱=糖水消耗/总液体消耗×100%）。

1.5 荧光定量 PCR 法检测大鼠胃组织RhoA 及ROCK的mRNA 水平表达 取大鼠胃组织，提取总mRNA，反转录cDNA 作为荧光定量PCR 反应的模板，根据待测基因的序列设计引物，见表1。反应后，通过 PCR分析软件对结果进行实时定量分析，RhoA，ROCK1和ROCK2 的相对表达量采用 2－△△Ct计算。

表1 引物序列

1.6 统计学方法 采用 SPSS 18.0 统计软件进行分析，数据以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，检验水平α=0.05。

2 结果

2.1 胃纵行平滑肌肌条收缩的活动 胃平滑肌肌条的收缩曲线图显示四磨汤能增强胃平滑肌的收缩；抑制剂Y27632 作用后，四磨汤对胃平滑肌肌条的收缩的频率较之前作用明显减慢。见图1，图2。

图1 大鼠胃平滑肌肌条自发性收缩活动

图2 大鼠胃平滑肌肌条频率增强率变化

2.2 模型鉴定实验结果

2.2.1 症状及体征检测 观察整个造模阶段大鼠的体征变化，模型组大鼠在碘乙酰胺灌胃期间，乳鼠长有微绒毛，但没有被毛，体征没有明显的变化。分笼后模型组大鼠的皮毛都较顺滑光泽，精神状态良好，粪便呈椭球形且干稀适中，与正常组无异。小平台站立期间模型组大鼠，皮毛略粗糙，精神状态不佳，到处乱窜，比较难抓持，警觉性高，回到笼子里后蜷缩在一起，大便干燥。正常组大鼠精神状态良好，大便正常。

2.2.2 旷场试验检测 通过录像视频的观察计算大鼠的穿个次数和站立次数。见表2。

表2 大鼠旷场实验运动情况的比较（，n =5）

表2 大鼠旷场实验运动情况的比较（，n =5）

注：与正常组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

2.2.3 糖水试验检测 见图3。

图3 大鼠糖水消耗百分比

2.3 功能性消化不良大鼠胃组织RhoA 及ROCK 的mRNA 表达比较 见图4。

图4 RhoA 及ROCK 的mRNA 水平表达

3 讨论

现代医学认为，胃肠动力障碍、容受性舒张破坏、内脏高敏感、胃肠激素、精神状态等与功能性消化不良有关[6]。四磨汤源于《重订严氏济生方》[7]，由木香、枳壳、乌药、槟榔四味组成。《本草纲目》记载：木香乃三焦气分之药，能升降诸气；枳壳长于行气宽中除胀，消积导滞，破坚消胀，开痰逐水，通便；乌药辛散温通，通理上下诸气，顺气降逆，有散寒行气兼以温肾之功；槟榔破坚宣壅，消食通肠，行气导滞以除腹满。四磨汤在临床上常用于治疗FD 胃动力障碍[8]。对其关于胃窦平滑肌收缩与钙离子通道研究报道较多[9]，但与钙敏化机制关系研究较少。钙敏化机制为非钙依赖性机制，对平滑肌收缩的维持起到重要的调节作用。钙敏化机制是通过使磷酸化肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化增强，增加对钙离子的敏感性，进一步增强使平滑肌的收缩[10]。钙敏化机制主要是通过RhoA 及其下游效应分子ROCK 介导[11]。Rho是一种小分子 G 蛋白，是 Ras 蛋白超家族成员之一；ROCK 是Rho 激酶，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，主要有ROCK1 和 ROCK2 两种亚型。RhoA/ROCK 对胃平滑肌收缩发挥重要作用。

Y27632 是RhoA/ROCK 信号通路抑制剂[12]，本研究中使用四磨汤和Y27632 作用胃窦及胃底肌条，发现四磨汤对胃窦及胃底平滑肌的作用是否与RhoA/ROCK 信号通路有关。四磨汤作用平滑肌肌条后，胃窦及胃底平滑肌收缩的作用增强。当四磨汤和Y27632共同作用平滑肌肌条，四磨汤对胃窦及胃底平滑肌肌条收缩的频率较处理前明显降低，提示四磨汤可能通过RhoA/ROCK 信号通路干预功能性消化不良胃动力障碍。采用碘乙酰胺灌胃，孤养和小平台复合因素造模建功能性消化不良大鼠模型。通过大鼠状态、旷场试验和糖水试验，验证大鼠功能性消化不良模型。通过分子生物学方法检测模型及四磨汤干预大鼠的胃组织RhoA 及ROCK 的mRNA 水平表达。本研究结果表明，模型组大鼠组的RhoA 及ROCK 蛋白mRNA 表达下降。四磨汤干预后，RhoA 及ROCK 蛋白mRNA 表达上升。提示四磨汤与功能性消化不良胃RhoA/ROCK有一定的相关性。

综上所述，四磨汤与胃组织RhoA/ROCK 表达相关，且四磨汤对功能性消化不良的改善作用可能与RhoA/ROCK 相关。