黄锦 加加林 姚雅馨 陆思嘉 党玉姣 乔杰 刘平

近年来胚胎培养液中存在游离DNA(cell free DNA，cfDNA)已经在生殖领域引起了越来越多的关注[1]。有学者利用囊胚培养液中cfDNA检测囊胚的整倍性[2-3]。由于胚胎培养液中游离DNA来源复杂而且含量极少，这给检测胚胎整倍性的准确性带来困难，也限制了在临床上的广泛应用。本文以囊胚培养液cfDNA检测重要染色体(13、15、16、18、21、22号染色体)整倍性为切入点，探讨利用cfDNA检测囊胚整倍性的效率。

材料与方法

一、材料

本研究共纳入239枚囊胚，所有的胚胎均来源于北京大学第三医院生殖中心的胚胎植入前遗传学筛查(preimplantation genetic testing for aneuploidy PGT-A)周期。PGT-A指征为女方高龄(>38岁)、复发性流产、反复着床失败。本研究获得北京大学第三医院医学伦理委员会批准，所有患者均在进入周期前签署知情同意书。

二、研究方法

1.促排卵和受精方式：按照本中心常规用药及监测方案进行控制性超排卵，注射HCG后36 h经阴道B超引导下卵泡穿刺取卵。所有周期都采用单精子卵母细胞内注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)方式受精。受精后16 h～18 h观察受精情况，第三天选择4细胞以上、碎片<50%的胚胎(多PN来源胚胎除外)进行囊胚培养，第三天或者第四天进行单胚胎单培养滴培养，每个培养滴大约20 uL左右。

2. PGT-A胚胎活检与遗传诊断：选择4期以上、滋养层细胞或者内细胞团其中一项评级为B以上的囊胚(Gardner评分标准[4])进行活检，激光活检3～5个滋养层细胞。活检的滋养层细胞采用SNP芯片检测胚胎的整倍性进行遗传检测，SNP array 芯片采用ILLUMINA公司的Human CytoSNP 12V-2.1芯片，活检后的细胞采用多重置换扩增(multiple displacement amplification, MDA)方法全基因组扩增后，杂交至芯片，扫描后的数据采用Illumina Genome Studio软件分析[5]。活检后的囊胚进行玻璃化冷冻。

3.培养液收集与检测：囊胚活检后，留取相应的培养液滴至PCR管中，-20℃保存。所有收集的囊胚培养液样本均进行无创胚胎染色体筛查(noninvasive chromosome screening, NICS)(亿康基因公司)检测整倍性，即先将样本进行多次退火环状循环扩增(multiple annealing and looping based amplification cycles，MALBAC)扩增后，采用NGS方法检测整倍性[6]。

4.统计方法：采用盲法获得囊胚的PGT-A结果和培养液的NICS结果。本研究着重针对13、15、16、18、21、22号染色体整倍性进行研究。以PGT-A结果为参照指标，分别统计每个囊胚培养液NICS相应染色体结果的真阳性(true positive，TP)(PGT-A、NICS结果均异常)、假阳性(false positive，FP) (PGT-A正常、NICS异常)、真阴性(true negative，TN)(PGT-A、NICS均正常)、假阴性(false negative，FN)(PGT-A异常、NICS正常)等样本数。进而计算出NICS在检测这些染色体整倍性的敏感度(sensitivity)、特异度(specificity)、诊断效率(efficiency)、阳性预测值(positive predict value，PPV)和阴性预测值(negative predict value，NPV)。具体计算公式如下:敏感度=TP/(TP+FN)；特异度=TN/(TN+FP)；效率=(TP+TN)/(TP+FP+TN+FN)；阳性预测值=TP/(TP+FP)；阴性预测值=TN/(TN+FN)。

结 果

一、基本情况

本研究纳入239枚囊胚，其中209枚囊胚对应的培养液游离DNA有NICS结果，NICS检出率为87.5%(209/239)。

以209枚囊胚的PGT-A结果做参照，统计这些囊胚13、15、16、18、21、22号染色体NICS结果的真阳性胚胎数、假阳性胚胎数、真阴性胚胎数、假阴性胚胎数，结果见表1。根据公式，计算出这些重要染色体NICS诊断的敏感度、特异度、诊断效率、阳性预测值和阴性预测值，结果见表2。

表1 209枚囊胚重要染色体NICS结果的统计资料

表2 重要染色体整倍性的NICS检测结果分析(%)

讨 论

非整倍体胚胎是导致IVF妊娠率降低，流产率、胎儿畸形率升高的一个重要原因[7]。目前，临床上利用胚胎植入前遗传学筛查(PGT-A)技术检测胚胎的整倍性。但是，PGT需要进行胚胎活检获取细胞进行整倍性分析的，对于胚胎是一种有创性的操作，仅在一些特殊人群(如女方高龄、复发性流产、反复着床失败的患者)中应用。因此，寻求更加微创甚至无创的胚胎诊断方法成为生殖领域的研究热点。

近年来，有学者发现胚胎的培养液中含有微量的游离DNA，可以反映胚胎的整倍性，为无创胚胎植入前遗传学检测提供了前景[1]。但是，临床上用于培养胚胎的培养液体积很小，内含cfDNA含量极其微少，甚至少于一个细胞的含量，且DNA的状态存在片段化和碎片化的情况，这都给临床上的应用带来困扰。

非整倍体对临床不良妊娠结局有重要影响。在临床应用中，不论是PGT还是培养液cfDNA，整倍体的检测结果引人关注，因为这些对应的胚胎是可利用胚胎。但是对于非整倍体的检测结果，同样也要关注非整倍体的具体染色体情况，因为不同染色体的非整倍性情况对胚胎发育及着床有着不同的影响。课题组前期研究显示[8]，某些非整倍体在胚胎中比例较高，但是在流产的绒毛检测结果中很少见到(例如16单体、22单体等)，这意味着这些非整倍性状态严重影响胚胎的早期发育和着床；同时也发现，某些非整倍体在胚胎和流产绒毛中的比例均较高(例如16三体、21三体等)，这就意味着这些非整倍体状态导致流产机会大，因此，对于早期胚胎筛查，应着重关注这些染色体的整倍性。参照无创产前DNA检测(non-invasive prenatal testing，NIPT)内容,本研究着重研究13、15、16、18、21、22号染色体的非整倍性。

本研究中，以PGT-A的检测结果为参照，计算cfDNA的NICS检测结果的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值等指标。研究结果显示，NICS对这些重要染色体检测的特异性、效率比较高，均>90%，NICS结果的阴性预测值超过97%；但是敏感性波动较大(33%～100%)，阳性预测值较低，<50% (详见表2)。

这些结果表明，如果cfDNA检测这些染色体为整倍体，那么对应胚胎这些染色体为整倍体的概率很高(阴性预测值>97%)；但是，如果cfDNA检测这些染色体为非整倍体，那么对应胚胎这些染色体为非整倍体的概率并不高(阳性预测值<50%)。这些结果也再次表明培养液中cfDNA的细胞来源复杂，利用培养液中cfDNA检测胚胎的整倍性目前还存在一定局限性，应以胚胎筛查为目的而不是以诊断胚胎为目的。

目前，已经有多项关于培养液cfDNA与囊胚整倍性相关的研究。意大利的研究团队研究了115枚囊胚培养液cfDNA与滋养层细胞整倍性，一致性可以达到78.7%，敏感度、特异度分别为94.5%和71.7%[9]。Huang等人的研究团队则比较了滋养层细胞、囊胚培养液中cfDNA以及整个囊胚的整倍性，研究结果显示，cfDNA检测结果与整个囊胚的检测结果的一致率要高于滋养层活检细胞的检测结果；但该研究对象是捐赠囊胚，培养液样本收集是解冻囊胚培养24 h后采样，这与临床实际情况存在一定差异[10]。在本研究中，NICS检出率为87.5%(209/239)，NICS结果与PGT-A结果的一致性并不是高度吻合，分析主要原因在于以下几点：首先，样本来源不同，PGT-A检测的样本为囊胚滋养层细胞，NICS检测的样本是培养液中cfDNA，cfDNA有可能是囊胚细胞释放，也可能来自于胚胎发育过程中其他细胞的DNA释放。其次，检测平台不同，PGT-A检测采用MDA全基因组扩增后进行SNP芯片检测，NICS检测采用MALBAC全基因组扩增后进行NGS检测。

探索无创胚胎检测方法是生殖领域近年来探索的热点，检测培养液中cfDNA的整倍性便为其中之一。本文检测cfDNA的重要染色体(13、15、16、18、21、22号染色体)整倍性为切入点，研究结果提示，NICS方法的特异性和阴性预测值较好，当NICS结果显示这些重要染色体为整倍体时，对应胚胎该条染色体整倍性概率高；但是当NICS结果显示这些重要染色体为非整倍体时，对应胚胎并不一定为非整倍体。相信随着NICS技术不断提高，该技术有望在临床中得到应用。