曹政，格格其木格，徐晓泉，3，翟少钦，付文贵，朱买勋

1. 重庆市畜牧科学院，重庆 402460；2. 内蒙古阿伊萨畜牧业发展有限公司，内蒙古 锡林郭勒盟 027200；3. 重庆棠城畜牧科技有限公司，重庆 402460

壳聚糖是一类天然多糖类高分子材料，是氨基葡萄糖与N-乙酰葡萄糖胺的共聚合物，属于低毒性大分子聚合物，具有较好的生物相容性和可降解性，目前在药剂和化妆品行业中的使用已经较为广泛［1-5］。有研究表明，壳聚糖的前体甲壳素可通过激活甘露糖受体、TLR-2 和Ⅰ型凝集素等抗原模式识别受体诱导机体产生天然免疫反应［6-7］。且壳聚糖可上调体外培养的DC 表面CD80 及CD60 等分子表达，促进DC 分泌IL-6、IL-12 等促炎症因子，有助于激活T细胞接受的免疫应答。在细胞水平试验中，壳聚糖与常用铝胶佐剂最显著的差别为壳聚糖可促进DC分泌IL-12，而铝胶佐剂可抑制DC 分泌IL-12，这充分说明壳聚糖在诱导Th1 型细胞免疫反应方面具有优势［8-9］。Th1 型细胞免疫在病毒性疾病感染过程中，以及在有效的细胞免疫应答等清除病毒感染过程中起到至关重要的作用，同时质子化的壳聚糖可使动物细胞膜形成短暂的通道，有效提高疫苗抗原跨膜运输效率，因此，売聚糖的免疫増强作用已经得到了一定的证实［10-11］。由于分子特性限制，壳聚糖不能溶解于生理pH 环境，仅可在酸性环境中形成质子化的可溶壳聚糖，同时壳聚糖溶液还存在黏度较大、难以湿热灭菌等使用问题，严重限制了壳聚糖作为疫苗佐剂的应用及推广。因此近年的报道多为壳聚糖佐剂纳米颗粒的佐剂特性研究。ABDEL ALLAH 等［12］报道，壳聚糖纳米颗粒被明矾及海藻酸钠包被后，可具备良好的水溶性即生物相容性，且具有较好的缓释特性。作为甲型肝炎疫苗佐剂使用时，可促进IL-4 和IL-2 的分泌，诱导机体产生良好的 IFNγ 和 IL-10，且促进 Th1 和 Th2 免疫应答方面保持平衡，显现出良好的佐剂特性。EI-SISSI 等［13］发现，壳聚糖纳米颗粒携带裂谷热病毒的灭活抗原后，可显著提高中和抗体效价，并可上调 IL-2、IL-4和IFNγ 基因的表达，促进Th1 型免疫应答。且ZHAO等［14］报道，壳聚糖纳米颗粒作为黏膜疫苗佐剂，可有效诱导机体产生IgA、IgG 抗体，并活化树突状细胞，促进免疫反应。

目前壳聚糖纳米颗粒的制备在各个领域应用的研究已被广泛报道［15-18］，但由于生产工艺以及生产成本的影响，目前壳聚糖纳米颗粒并不适用于兽用疫苗领域。

本研究利用壳聚糖可以在酸性条件下溶解的特点，并借鉴壳聚糖纳米颗粒制备的方法，先使壳聚糖在酸性条件下完全溶解，再缓慢调节pH，使已经溶解的大分子壳聚糖缓慢析出，形成类似纳米颗粒的分散状态的再生壳聚糖。之后再利用不同pH 的缓冲体系对不同浓度的再生壳聚糖进行复溶，筛选并建立了制备pH 接近中性的再生壳聚糖无菌溶液的方法。

1 材料与方法

1. 1 疫苗 山羊痘活疫苗和猪瘟活疫苗（细胞源）购自重庆澳龙生物制品有限公司。

1. 2 主要试剂 壳聚糖（脱乙酰甲壳素）购自山东绿英化工科技有限公司，分析纯；铝胶疫苗稀释液由重庆澳龙生物制品有限公司提供；氯化钠注射液（生理盐水）购自广东圣戈生物科技有限公司；山羊痘抗体（Pox-Ab）ELISA 试剂盒购自泉州市睿信生物科技有限公司；猪瘟抗体（CSF-Ab）ELISA 试剂盒购自齐一生物科技（上海）有限公司。

1. 3 实验动物 健康山羊（散养，4 ~ 6 月龄，未接种疫苗）和健康育肥猪（集约化养殖，6 月龄，猪瘟抗体呈阴性）均由内蒙古阿伊萨畜牧业发展有限公司提供。本实验均以科研为目的进行实验动物的养殖和使用，且按照实验动物伦理相关规定进行。

1. 4 壳聚糖稀释液的制备 根据表1 配制不同pH的 0. 2 mol ／ L 磷酸-柠檬酸缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液及磷酸盐缓冲液。称取1 ~ 5 g 壳聚糖分别加至100 mL 不同pH 的3 种缓冲溶液中，室温下搅拌30 min 至澄清，10 000 × g 离心 10 min，去除杂质，上清即为可溶壳聚糖稀释液（soluble chitosan diluent，SCD）。取任意一种缓冲体系的SCD 稀释液，缓慢添加 1 mol ／ L NaOH 至沉淀完全析出，2 000 × g 离心10 min，收集沉淀，去离子水洗涤2 ~ 3 次并凉干，即为再生壳聚糖。取1 ~ 5 g再生壳聚糖，分别用不同pH 的3 种缓冲体系溶解，室温下搅拌30 min 至澄清，10 000 × g 离心10 min，去除杂质，上清即为再生壳聚糖稀释液（regenerated chitosan diluent，RCD）。将制备的各种SCD 及RCD 用相应缓冲体系的共轭酸盐调pH 接近中性后，115 ℃（68 kPa）湿热灭菌30 min，记录壳聚糖及再生壳聚糖在不同缓冲体系中的溶解特性等参数。

表1 缓冲液配制表Tab. 1 Formula of buffer

1. 5 壳聚糖稀释液最佳浓度筛选 将制备好的SCD及RCD 分别用相应缓冲体系制备成0. 5%、1%、2%浓度的溶液，用不同浓度的SCD 及RCD 将山羊痘活疫苗稀释成1 头份 ／ mL，分别免疫健康山羊，颈部皮下注射，1 mL ／ 只，共 10 只，同时用生理盐水以同样方式稀释疫苗并免疫动物作为对照。根据表2持续监测动物健康状态，并在第1 次免疫后14 d，按同样方法进行第2 次免疫。采集第1 次免疫前、免疫后14 d 及第2 次免疫后14 d 静脉血并分离血清，利用山羊痘抗体（Pox-Ab）ELISA 试剂盒检测血清ELISA 抗体效价。

表2 临床检测内容Tab. 2 Clinical tests

1. 6 壳聚糖稀释液对山羊痘活疫苗安全及效力影响的检测 用壳聚糖稀释液、铝胶稀释液及生理盐水分别将山羊痘活疫苗稀释成1 头份 ／ mL，分别免疫健康山羊。每组免疫50 只，每只颈部皮下注射1 mL。免疫前先采集静脉血并分离血清备用，免疫后持续监测72 h 体温变化。第1 次免疫后14 d 采集静脉血并分离血清，按同样方法进行第2 次免疫。第2 次免疫后14 d 采集静脉血并分离血清。利用山羊痘抗体（Pox-Ab）ELISA 试剂盒检测血清ELISA 抗体效价。

1. 7 壳聚糖稀释液对猪瘟疫苗（细胞源）安全及效力影响的检测 用壳聚糖稀释液、铝胶稀释液、疫苗自带稀释液（Z1 稀释液）及生理盐水分别将猪瘟活疫苗（细胞源）稀释成1 头份 ／ mL，分别免疫健康育肥猪。每组免疫10 头，每头在耳根背后皮下注射1 mL。免疫前先采集前腔静脉血并分离血清，免疫后持续监测72 h 体温变化。第1 次免疫后14 d 采集前腔静脉血并分离血清，按同样方法进行第2 次免疫。第2 次免疫后14 d 采集前腔静脉血并分离血清。利用猪瘟抗体（CSF-Ab）ELISA 试剂盒检测血清ELISA 抗体效价。

1. 8 统计学分析 采用Graphpad prism 8 软件进行抗体水平的比较分析，通过单因素方差分析（One-way ANOVA）对不同实验组的抗体水平进行分析，以P <0. 05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2. 1 壳聚糖稀释液的制备 结果显示，壳聚糖在任何pH 的磷酸-柠檬酸缓冲液及磷酸盐缓冲液中均不能溶解，仅在部分pH 的醋酸-醋酸钠缓冲液中可以溶解；同时利用醋酸-醋酸钠缓冲体系制备的再生壳聚糖，仍然不能在上述2 种缓冲体系中溶解。无论壳聚糖或再生壳聚糖，其溶解程度均会随着体系pH逐渐升高或溶质浓度逐渐增加而下降。其中，1%浓度的壳聚糖可在pH 5. 2 以下较好地溶解，最大溶解程度为pH 4. 0 ／ 3%。而再生后的壳聚糖2%浓度时在pH 6. 0 时仍能较好地溶解，最大溶解程度为pH 4. 0 ／ 5%。见表3。表明醋酸-醋酸钠缓冲液是一种溶解壳聚糖或制备再生壳聚糖较为理想的缓冲体系。同时可推断，壳聚糖经过溶解-析出-再溶解的再生过程，溶解度会有所提升。

表3 壳聚糖在醋酸-醋酸钠缓冲溶液中的溶解特性Tab. 3 Dissolution characteristics of chitosan in acetic acidsodium acetate buffer

将1%~5%的SCD 及RCD 115 ℃湿热灭菌30 min后，原本在pH 5. 2 条件下清澈透明的1% SCD，经湿热灭菌后呈现为茶色，而2% pH 6. 0 的RCD 也变为黏稠状液体。见表4。表明湿热灭菌对壳聚糖溶解度的影响是随着pH 以及壳聚糖浓度增加而增强的，最终会导致溶液颜色逐渐加深，且状态也逐渐变得黏稠，直至成为棕黑色的膏状物体。通过结果可以推断，湿热灭菌条件下，应使用pH 4. 0 的醋酸-醋酸钠缓冲液制备1%可溶壳聚糖缓冲液（SCD），而pH 4. 6 的醋酸-醋酸钠缓冲液可制备2%再生壳聚糖缓冲液（RCD）。

表4 湿热灭菌后溶液变化Tab. 4 Properties of solution after sterilization by moist heat

综上所述，壳聚糖稀释液的制备流程为：①SCD：应使用0. 2 mol ／ L pH 4. 0 醋酸-醋酸钠缓冲液配制1%浓度的壳聚糖，离心去除杂质后，115 ℃湿热灭菌30 min，最后用 1 mol ／ L 无菌醋酸钠溶液调 pH 至5. 2。②RCD：应使用 0. 2 mol ／ L pH 4. 0 醋酸-醋酸钠缓冲液配制3%浓度的壳聚糖溶液，离心去除杂质后，上清滴加浓度为 1 mol ／ L 的 NaOH 至沉淀完全析出。低速离心收集再生壳聚糖，并用0. 2 mol ／ L pH 4. 6 醋酸-醋酸钠缓冲液配制成2%浓度的再生壳聚糖溶液，115 ℃湿热灭菌30 min，最后用1 mol／L无菌醋酸钠溶液调pH 至6. 0。

2. 2 壳聚糖稀释液的最佳浓度 用制备的稀释液稀释山羊痘活疫苗并免疫山羊后，各组安全性检测结果无差异，采食、行为、精神状态、粪便均未出现异常，局部均无病变。虽然各试验组山羊体温未超过正常体温（38. 3 ~ 39. 9 ℃），但 1% SCD、2% SCD 及2% RCD 试验组在免疫后2 ~ 12 h 内出现体温升高现象，最高达39. 8 ℃，见表5。第2 次免疫后14 d解剖结果显示，上述3 组在颈部皮下的注射部位均存在大小不规则的硬块，各组肺、肝、脾、肾、胰腺未见异常。表明壳聚糖浓度增大后会难以吸收，并在局部引起炎症反应，从而引发体温升高，当壳聚糖经过再生后，会缓解这一现象。

表5 各组山羊体温检测结果（℃，，n = 10）Tab. 5 Body temperatures of goats in various groups（℃，，n = 10）

表5 各组山羊体温检测结果（℃，，n = 10）Tab. 5 Body temperatures of goats in various groups（℃，，n = 10）

组别 0 h 2 h 12 h 24 h 72 h 0. 5% SCD 试验组 38. 6 38. 9 38. 6 38. 0 38. 9 0. 5% RCD 试验组 38. 7 38. 3 38. 9 38. 8 38. 4 1% SCD 试验组 38. 3 39. 6 38. 7 38. 5 39. 6 1% RCD 试验组 38. 7 38. 1 38. 6 38. 5 38. 4 2% SCD 试验组 38. 6 39. 8 39. 4 38. 2 38. 4 2% RCD 试验组 38. 5 39. 6 39. 1 38. 5 38. 6生理盐水对照组 38. 4 38. 9 38. 9 38. 5 38. 7

ELISA 结果显示，在第1 次免疫后14 d，各组壳聚糖稀释液的抗体均达到一个较高的水平，1% SCD、1%RCD 和2%RCD 试验组与对照组相比，差异均有统计学意义（P 分别为 0.005 1、0.006 1 和 0.008 8），其余各组差异也均有统计学意义（P 均 ＜0. 05），见图1。表明各试验组壳聚糖稀释液起到了良好的佐剂性能，且0. 5% ~ 2% SCD 及RCD 均可激发良好的免疫应答。综合以上结果，0. 5% SCD 和0. 5%、1% RCD 均具备较好的安全性及良好的佐剂性能，可作为疫苗稀释液使用。结合制备方法及制备成本等因素考虑，最终选择pH 6. 0 0. 5% RCD 作为最佳稀释液配方。

图1 不同浓度壳聚糖稀释液的安全及效力试验Fig. 1 Safety and efficacy test on chitosan diluents at various concentrations

2. 3 壳聚糖稀释液对山羊痘活疫苗安全及效力的影响 用0. 5% RCD（pH 6. 0）、铝胶稀释液及生理盐水稀释山羊痘活疫苗并免疫山羊后，0. 5% RCD与生理盐水均未激发动物体温升高，铝胶稀释液在注射后12 h 内造成动物体温升高约1 ℃，见图2A。表明0. 5% RCD 在群体免疫时具备与生理盐水一样的适应性及安全性。

ELISA 结果显示，0.5%RCD 在第 1 次免疫后，即产生了高于铝胶稀释液及生理盐水的抗体水平，见图2B，表明该稀释液在保证安全性的同时，有效地提升了疫苗的免疫效果，适合作为兽用疫苗稀释液。

图2 不同稀释液稀释山羊痘活疫苗免疫山羊后的体温观察（A）和抗体效价检测（B）Fig. 2 Body temperature（A）and antibody titer（B）of goats immunized with live pox vaccine diluted with various diluents

2. 4 不同稀释液对猪瘟活疫苗（细胞源）安全及效力的影响 用0. 5% RCD（pH 6. 0）、铝胶稀释液、生理盐水及疫苗自带稀释液（Z1）分别稀释猪瘟活疫苗（细胞源）并免疫育肥猪，72 h 后，仅铝胶稀释液组出现约1 ℃的体温升高，其他3 组均无明显的体温反应，见图3A。抗体水平检测结果也与预期一致，即0. 5%RCD 在第1 次免疫后即达到了其他组需2 次免疫才达到的抗体水平，见图3B。表明制备的0.5%RCD具备与生理盐水一致的动物适应性及安全性，同时具备理想的免疫增强作用。因此，推断本实验制备的RCD 兽用疫苗稀释液具有作为兽用疫苗稀释液的应用潜力，尤其适用于动物的大规模疫苗免疫。

图3 不同稀释液稀释猪瘟活疫苗（细胞源）免疫育肥猪后的体温观察（A）和效价检测（B）Fig. 3 Body temperature（A）and antibody titer（B）of fattening pigs immunized with classical swine fever vaccine diluted with various diluents

3 讨 论

在草原牧区对散养的大规模的动物进行疫苗免疫时，普遍存在免疫效果参差不齐，而且动物在免疫后1 ~ 3 d 内出现规模性的进食减少、行动不便等现象。免疫效果不理想是由于动物数量庞大以及缺乏动物保定设备，兽医人员难以均一地注射足够剂量的疫苗导致的。因此在临床实际操作中，兽医人员往往加大剂量进行免疫注射，同时伴随反复追逐捕捉动物并造成动物间挤压、踩踏等机械性损伤，最终导致动物在注射疫苗后常大面积出现行动不便、进食减少、注射部位溃烂甚至死亡等现象。本研究是针对草原牧区的工作特点，建立一套再生壳聚糖兽用疫苗稀释液的制备方法，目的是利用壳聚糖的吸附性以及激活免疫系统等特点，在有效提高疫苗免疫源性的同时，减轻临床工作强度，避免副反应发生。

壳聚糖是一种天然的大分子物质，具有良好的激发天然免疫的能力，但由于其分子结构的限制，壳聚糖仅能在酸性条件下溶解，且黏度较大。本研究采用0. 2 mol ／L pH 4. 0 醋酸-醋酸钠缓冲液配制了3%浓度的壳聚糖溶液，之后利用滴加高浓度NaOH 的方式使已经完全溶解的壳聚糖均匀地析出，经去离子水反复洗涤并干燥后得到再生壳聚糖。经过再生后的壳聚糖再用0. 2 mol ／ L pH 4. 6 醋酸-醋酸钠缓冲液配置成2%浓度溶液，溶液的黏度下降，溶解度也有所增加，且可耐受115 ℃湿热灭菌而不变性。经高压灭菌后的再生壳聚糖溶液经稀释后，用无菌醋酸钠调pH 至6. 0，最终可得到pH 接近中性、性状理想的RCD，有效地解决了壳聚糖溶解度较低、黏度较大、溶解pH 较低等不利因素。

本研究安全性及免疫应答试验结果显示，采用0.5%RCD 作为疫苗稀释液时，不仅具有等同与生理盐水的动物适应性及安全性，而且可有效提高山羊痘活疫苗以及猪瘟活疫苗的免疫原性。ELISA 检测结果显示，使用0.5%RCD 稀释的山羊痘活疫苗以及猪瘟活疫苗，在第1 次免疫14 d 后，抗体水平可达到其他稀释液免疫2 次后才能达到的抗体水平。推断本研究使用的0. 5% RCD 在免疫剂量不足（单次免疫）时，即可有效地激发良好的免疫应答，尤其适合作为大规模动物免疫时使用的疫苗稀释液。