吴 瑕，刘秀菊，杨秀岭，马颖超，吴 迪（.河北医科大学第二医院药学部，河北 石家庄 050000；.河北医科大学第二医院检验科，河北 石家庄 050000）

达托霉素是从发酵的链霉菌属玫瑰色孢子中提取的具有独特环状结构的新型环脂肽类抗生素[1]，主要通过干扰细胞膜对氨基酸的转运、阻碍细菌细胞壁的生物合成、改变细胞膜电位等多种机制破坏细菌细胞膜功能，从而对耐甲氧西林和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌和耐万古霉素肠球菌等革兰阳性菌起到杀菌作用，治疗成人复杂性皮肤及软组织感染、菌血症和心内膜炎[2]，是万古霉素治疗失败的右心感染性心内膜炎的替代药物[3]。

达托霉素主要以原型通过肾脏排泄，肾损伤时消除半衰期明显延长，肾功能异常患者需调整给药剂量[4]。达托霉素治疗不同感染的给药剂量存在差异，用于皮肤软组织感染的剂量为4 mg·kg-1·d-1，治疗菌血症及感染性心内膜炎剂量为 6 mg·kg-1·d-1，《桑福德抗微生物治疗指南》[5]推荐治疗耐万古霉素肠球菌感染剂量为8 ～ 12 mg·kg-1·d-1，不同给药剂量导致稳态血药浓度差异较大，且该药具有潜在的肌肉毒性和肾毒性[6]，因此开展治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM）可以为临床安全用药提供数据支持。国内外文献报道中主要采用HPLC法测定发酵液、原料药、制剂中的达托霉素浓度[7-11]，但检测人血浆中药物浓度的报道较少，本研究拟建立一种简单快捷、经济实用的HPLC法检测患者血浆中达托霉素的浓度，旨为临床患者进行TDM提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪（配2489型紫外检测器），Diamonsil C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；低温冷藏箱（MDF-U2086S，日本三洋公司）；涡旋混合器（XW-80A，上海医科大学仪器厂）；高速离心机（离心半径50 mm，美国ABBOTT）；冷藏柜（YC-180，澳柯玛公司）；电子分析天平（CPA225D，德国Sartorius公司）；台式酸度测定仪（pH 213，意大利HANNA公司）

1.2 试药

达托霉素对照品（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：683190401RS，含量93.9%）；卡马西平对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100142-201706，含量100.0%）；人血浆由河北省血液中心提供；乙腈（赛默飞世尔科技有限公司，批号：25962，分析纯）；其他试剂均为分析纯；水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Diamonsil C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-100 mmoL·L-1磷酸二氢铵溶液（38∶62，v/v，pH = 3.5）；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长214 nm；进样量10 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 达托霉素对照品储备液取达托霉素2.13 mg精密称定，置于5 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解定容，配制成含达托霉素400 μg·mL-1的储备液，置于4 ℃储存备用。

2.2.2 卡马西平对照品储备液取卡马西平1.25 mg精密称定，置于25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解定容，配制成含卡马西平50 μg·mL-1的储备液，于4 ℃储存备用。

2.3 血样处理

在1.5 mL离心管中加入100 μL血浆及10 μL内标卡马西平溶液，加入300 μL乙腈沉淀蛋白，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液进行分析。

2.4 方法专属性考察

取人空白血浆、人空白血浆+达托霉素对照品、人空白血浆+达托霉素对照品+内标马卡西平，涡旋混匀，分别按“2.3”项下方法处理后分析并记录色谱图。结果显示达托霉素及内标卡马西平峰形良好，与人空白血浆中内源物质分离良好，保留时间分别为10.19、15.84 min。见图1。

图1 高效液相色谱图A - 人空白血浆，B - 人空白血浆+达托霉素，C - 人空白血浆+达托霉素+卡马西平；1 - 达托霉素，2 - 卡马西平Fig 1 HPLC chromatogramA - human blank plasma, B - human blank plasma + daptomycin, C -human blank plasma + daptomycin + carbamazepine; 1 - daptomycin,2 - carbamazepine

2.5 标准曲线与检测限、定量下限

用50%甲醇溶液将达托霉素储备液稀释至不同浓度，分别取20 μL置于1.5 mL离心管中氮气吹干，加入200 μL空白血浆及25 μg·mL-1内标卡马西平溶液20 μL，制成80、40、20、10、5、2 μg·mL-1达托霉素血浆样品，加入600 μL乙腈沉淀蛋白，涡旋混合2 min，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液常温氮气挥干，加流动相200 μL复溶，取10 μL进行HPLC测定，记录色谱图。以待测物浓度（X）为横坐标，待测物与内标物峰面积比值（Y）为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，得标准曲线方程：Y= 0.025 4X+ 0.059 9，r= 0.999 8，表明达托霉素在2 ～ 80 μg·mL-1范围内线性关系良好，检测限（S/N = 3）为0.5 μg·mL-1，定量下限（S/N = 10）为1 μg·mL-1。

2.6 精密度试验

取人空白血浆，制备低、中、高（5、20、60 μg·mL-1）浓度达托霉素血浆样品各5份，在同一天内处理并分析，计算日内精密度；连续3 d处理并分析，计算日间精密度。结果显示日内精密度RSD分别为3.58%、2.46%、5.37%，日间精密度RSD分别为4.16%、3.28%、6.50%。

2.7 回收率试验

2.7.1 提取回收率取人空白血浆，制备低、中、高（5、20、60 μg·mL-1）浓度达托霉素血浆样品各5份，按“2.3”项下方法处理后分析，测得的峰面积与相应浓度达托霉素对照品溶液直接进样所得的峰面积之比为提取回收率，分别为96.4%、102.3%、99.9%，RSD分别为3.6%、6.1%、5.2%。制备卡马西平血浆样品，按“2.3”项下方法处理后分析，内标峰面积与相应浓度的内标溶液直接进样所得峰面积之比为内标的提取回收率，为94.7%，RSD为8.1%。

2.7.2 方法回收率取人空白血浆，制备低、中、高（5、20、60 μg·mL-1）浓度达托霉素血浆样品各5份，分别按“2.3”项下方法处理后分析，按标准曲线计算真实浓度，真实浓度与理论浓度之比为方法回收率，分别为89.4%、82.2%、87.6%，RSD分别为2.6%、4.2%、5.1%。

2.8 稳定性试验

取人空白血浆，制备低、中、高（5、20、60 μg·mL-1）浓度达托霉素血浆样品各5份，按“2.3”项下方法处理后室温放置0、1、2、4、12 h后进行分析，考察室温放置稳定性。于-40 ℃冰箱低温保存5 d，按相应方法处理后分析，考察低温保存稳定性。反复冻融3次，按相应方法处理后分析，考察反复冻融稳定性。结果表明上述条件下样品均稳定，RSD均< 10%。

2.9 方法学应用

选取6例使用了达托霉素的临床患者（男性2例，女性4例），在血药浓度达到稳态后，于次日给药前30 min抽取静脉血3 mL测定血药浓度，浓度范围为8.25 ～42.27 μg·mL-1，所建方法能够满足患者血浆中达托霉素浓度检测要求。见表1。

表1 达托霉素血药浓度测定结果Tab 1 Results of daptomycin blood concentration

3 讨论

目前国内外已有LC-MS/MS法测定达托霉素血药浓度的报道[12-14]，可以快速测定更低的药物浓度。该药属于浓度依赖性抗生素，血药峰浓度58 μg·mL-1[4]，血药浓度决定抗菌疗效，药物浓度过低无法有效杀菌，因此低浓度的检测价值有待考量；且LC-MS/MS成本昂贵，很多医疗机构未配备质谱仪，不利于TDM和临床药学服务的开展。本文建立了一种简单、经济的HPLC测定法，更适用于达托霉素的血药浓度检测和药代动力学研究。

实验过程中对比了乙腈-水、乙腈-醋酸铵、乙腈-磷酸盐缓冲液等多种系统，参考相关研究[15]报道的乙腈-200 mmoL·L-1磷酸盐缓冲液，但盐溶液浓度过高容易堵塞色谱柱，最终选择乙腈-100 mmoL·L-1磷酸二氢铵（pH = 3.5）作为流动相。实验采用50%甲醇溶液配制达托霉素工作液，防止玻璃器皿和聚丙烯试管对药物的吸附[16]，降低实验误差。

达托霉素具有水溶性、分子量大、表观分布容积小（约0.1 L·kg-1）等药代动力学特点，主要分布于血浆和间质液中，与血浆白蛋白广泛可逆性结合（血浆蛋白结合率90% ～ 93%），当患者处于重症感染、低蛋白血症、循环血量变化等特殊病理生理状态下，表观分布容积明显增加[4]，易造成血药浓度波动大。一项在重症患者中进行的PK/PD研究证实，治疗MIC≥1 mg·L-1的细菌感染，当肌酐清除率> 60 mL·min-1或肌酐清除率较低但接受连续肾脏替代治疗时，给予4 mg·kg-1·d-1和6 mg·kg-1·d-1标准剂量有效达标率较低，需增加给药剂量，TDM可协助临床优化给药剂量，提高抗感染疗效[17]。本研究采用所建方法测定了6例临床患者的达托霉素血药浓度，检测结果在研究线性范围内，方法准确精密、操作简便，满足TDM的要求，可为临床安全、有效用药提供参考。