刘培发,侯文宇,菅雁兵

(中国人民解放军总医院第一医学中心,北京,100853)

乳腺癌是乳腺上皮细胞发生恶变的严重疾病，其早期症状以乳房肿块、乳头溢液等为主，经手术治疗后预后相对较好，但由于对早期症状不够重视，随疾病进展，癌细胞发生转移可致全身多器官病变，此时治疗难度大且患者远期存活的概率明显降低。研究[1]发现乳腺癌病情进展是多因素参与的复杂过程，相关基因及蛋白的异常表达在其发展过程中起重要作用。研究显示[2]多种微小核糖核酸(miRNAs)在乳腺癌组织中异常表达，参与癌变及患者预后情况。微小核糖核酸-485-3p(miR-485-3p)可在一定程度上调控乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药性[3]。Xklp2靶蛋白(TPX2)是一种参与细胞纺锤体合成的微管调节蛋白，其过表达与三阴性乳腺癌患者的预后有关[4]。已有研究[5]证实,miR-485-3p可通过靶向TPX2抑制大肠癌的发展。但miR-485-3p是否可通过靶向TPX2参与乳腺癌的恶变过程仍不清楚。因此，本研究通过检测乳腺癌组织miR-485-3p、TPX2表达，探讨二者在乳腺癌发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2014年1月—2016年1月在本院就诊并行手术切除的乳腺癌患者105例为研究对象。纳入标准:① 均符合乳腺癌诊断标准，并经术后病理证实[6]者;② 术前未接受抗肿瘤治疗者;③ 术中留取的乳腺癌组织及距癌组织5 cm以上的配对癌旁正常组织可用者;④均签署手术同意书者。排除标准:① 肝肾功能不全者;② 有其他恶性肿瘤者;③ 有血液疾病者;④ 临床资料不完整者。本研究经本院医学伦理委员会批准。

患者年龄30～65岁，平均年龄(48.07±12.39)岁;肿瘤直径<2 cm者47例，≥2 cm者58例;TNM分期包括Ⅰ期25例，Ⅱ期46例，Ⅲ期34例;有淋巴结转移45例，无淋巴结转移60例;孕激素受体(PR)表达:阴性53例，阳性52例;雌激素受体(ER)表达:阴性76例，阳性29例;人表皮生长因子受体-2(HER-2)表达:阴性57例，阳性48例;Ki-67表达:阴性44例，阳性61例。

1.2 方法

1.2.1 TPX2蛋白表达检测:术中留取的乳腺癌组织及癌旁正常组织固定(10%中性福尔马林)后，使用免疫组织化学SP法进行染色，具体步骤参照SP试剂盒(购自福州迈新生物技术开发有限公司)说明书进行。小鼠抗人TPX2单克隆抗体(购自上海瑶韵生物科技有限公司)稀释浓度为1∶500,阴性和阳性对照分别为磷酸盐缓冲液、已知阳性切片。结果判定:TPX2蛋白阳性主要定位于细胞核，显微镜下观察呈棕黄色颗粒。每张切片随机计数10个高倍视野(放大200倍)，观察阳性细胞数，并计算所占百分比。TPX2蛋白阳性:染色细胞比例≥10%;TPX2蛋白阴性:染色细胞比例<10%。

1.2.2 miR-485-3p、TPX2 mRNA表达水平检测:采用实时荧光定量聚合酶链反应检测组织中miR-485-3p、TPX2 mRNA的表达。首先提取组织中总RNA，提取方法参照深圳子科生物科技有限公司生产的Trizol试剂盒说明，然后使用酶标仪测定其浓度和纯度，合格后将其反转录为cDNA。miR-485-3p正向引物为5′-CCCGATAAAGCTAGATAACC-3′,反向引物为5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;内参U6正向引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCAC-3′,反向引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。TPX2 mRNA正向引物为5′-TTTGGTATCAGACCCGAAGC-3′,反向引物为5′-TCCCCATGTTTGTCAGTGAA-3′;内参GAPDH正向引物为5′-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′,反向引物为5′-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3′。反应条件为:95 ℃下10 min,95 ℃下15 s,60 ℃下1 min,72 ℃下10 s,以此程序反应45个循环。保存数据Ct值，并利用公式2∆∆-Ct计算miR-485-3p、TPX2 mRNA的相对表达量。

1.2.3 双荧光素酶报告实验:通过ENCORI数据库确定miR-485-3p和TPX2的结合位点，将TPX2的3′UTR序列插入pGL3荧光素酶报告载体的相应位点，构建野生型和突变型的表达载体，选取人上皮HEK293T细胞5×105个(均处于对数生长期)，根据脂质体转染试剂盒(武汉纯度生物科技有限公司)说明书将miR-485-3p过表达模拟物(miR-485-3p mimics)、miRNA 阴性对照(miR-NC)分别和野生型、突变型表达载体转染至HEK293T细胞，转染后48 h制备裂解物，并用双荧光素酶试剂盒(北京奥秘佳得医药科技有限公司)染色，实验重复3次，采用Promega GloMaxTM20/20发光检测仪(上海剑凌信息科技有限公司)检测荧光素酶相对活性。

1.2.4 随访:患者出院后，采用打电话及门诊复查的方式随访5年，随访终点为患者死亡或随访结束(2021年1月31日)。统计患者生存时间，计算5年总生存率。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 乳腺癌组织和癌旁正常组织中TPX2蛋白表达情况

乳腺癌组织中TPX2蛋白阳性率为76.19%,高于癌旁正常组织的37.14%,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

表1 乳腺癌组织和癌旁正常组织中TPX2蛋白表达情况

A:癌旁正常组织阴性;B:乳腺癌组织阳性。

2.2 乳腺癌组织和癌旁正常组织中miR-485-3p、TPX2 mRNA表达水平比较

乳腺癌组织中miR-485-3p表达水平低于癌旁正常组织,TPX2 mRNA表达水平高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 乳腺癌组织和癌旁正常组织中miR-485-3p、

2.3 乳腺癌组织中miR-485-3p、TPX2蛋白表达与临床病理特征的关系

以miR-485-3p均值进行分组，分为miR-485-3p低表达(<均值者)和miR-485-3p高表达(≥均值者)。乳腺癌组织中miR-485-3p、TPX2蛋白表达与患者年龄、肿瘤直径及PR、ER、HER-2表达无关(P>0.05),与患者TNM分期、淋巴结转移、Ki-67表达有关(P<0.05)。见表3。

2.4 miR-485-3p与TPX2 mRNA表达的相关性分析

经ENCORI数据库预测,miR-485-3p在TPX2的3′UTR存在相应的结合位点，见图2;双荧光素酶报告实验结果显示，与pGL3-TPX2+miR-NC相比,pGL3-TPX2-野生型+miR-485-3p mimics的荧光素酶相对活性降低，差异有统计学意义(P<0.05),而pGL3-TPX2-突变型+miR-485-3p mimics和pGL3-TPX2-突变型+miR-NC的荧光素酶相对活性相比，差异无统计学意义(P>0.05),见图3;Pearson检验分析显示，乳腺癌组织中miR-485-3p表达与TPX2 mRNA表达呈负相关(r=-0.507,P<0.05),见图4。

表3 乳腺癌组织中miR-485-3p、TPX2蛋白表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.5 乳腺癌组织中miR-485-3p、TPX2蛋白表达与患者总生存率的关系

乳腺癌患者5年总生存率为65.71%(69/105)。miR-485-3p高表达者、低表达者5年总生存率分别为77.78%、52.94%,差异有统计学意义(χ2=7.181,P=0.007);TPX2蛋白阴性者、阳性者5年总生存率分别为84.00%、60.00%,差异有统计学意义(χ2=4.870,P=0.027)。见图5。

图5 乳腺癌组织中miR-485-3p、TPX2蛋白表达与患者总生存率的关系

2.6 影响乳腺癌患者总生存的危险因素

COX回归分析显示，有淋巴结转移、miR-485-3p低表达、TPX2蛋白阳性是影响乳腺癌患者总生存的独立危险因素(P<0.05)。见表4。

3 讨 论

miRNAs是一类高度保守的小RNA,可通过与相关靶基因结合在乳腺癌恶变过程中发挥作用。WANG Y W等[7]研究报道,miR-4732-5p参与乳腺癌发生，且可通过靶向四跨膜蛋白13促进肿瘤进展。许发功等[8]研究发现，乳腺癌组织中miR-144-3p低表达，其低表达与患者预后不良有一定关联。因此，探讨乳腺癌组织中miRNAs表达水平，对乳腺癌的靶向治疗及改善患者近、远期预后有一定临床意义。

miR-485-3p是近年来较重视的一种miRNAs,具有抑制肿瘤细胞生长、转移的能力，在肿瘤耐药及预后中均具有重要作用[9]。WANG M等[10]研究发现,miR-485-5p可通过靶向生存素在乳腺癌进展及化疗敏感性中发挥抑制作用。WANG X等[11]研究报道，乳腺癌组织中miR-485-5p低表达，能与黏蛋白1的3′-非编码区结合抑制癌细胞的增殖、迁移。目前,miR-485-5p在乳腺癌中的作用较明确，但miR-485-3p与乳腺癌发生及患者预后的关系尚不十分明确。本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应检测miR-485-3p的表达，结果发现，乳腺癌组织中miR-485-3p表达水平较癌旁正常组织低;以miR-485-3p均值分为miR-485-3p低表达和高表达，结果显示，其与患者TNM分期、淋巴结转移、Ki-67表达有关，提示miR-485-3p表达可能参与乳腺癌的发生及病情进展。本研究绘制以miR-485-3p均值分组的Kaplan-Meier生存曲线，结果发现miR-485-3p低表达者5年总生存率相对较低，且COX回归结果显示miR-485-3p低表达与乳腺癌患者总生存独立相关，提示检测乳腺癌组织中miR-485-3p表达，可能对评估乳腺癌患者远期预后有所帮助。

表4 影响乳腺癌患者总生存的危险因素

TPX2定位于人染色体20q11.2,结构高度保守，具有维持细胞纺锤体稳定的作用[12]。近年来，相关研究[14-15]发现,TPX2具有癌基因的特性，其高表达与子宫内膜癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤的临床分期、复发及患者生存情况密切相关。一项研究[16]表明,TPX2在乳腺癌细胞迁移、侵袭中发挥一定作用。但TPX2异常表达与乳腺癌临床病理特征及患者预后的关系尚有待验证。本研究结果发现，乳腺癌组织中TPX2蛋白阳性率、TPX2 mRNA表达水平均较癌旁正常组织高，同时发现TPX2蛋白表达与患者TNM分期、淋巴结转移、Ki-67表达有关，提示TPX2表达可能在乳腺癌发病及病情进展中发挥作用。Kaplan-Meier生存曲线显示,TPX2蛋白阴性者5年总生存率明显高于阳性者，且COX回归分析发现TPX2蛋白阳性是影响乳腺癌患者总生存的独立危险因素，提示TPX2蛋白可能是判断乳腺癌患者远期生存情况的生物学指标之一。此外,ENCORI数据库预测miR-485-3p与TPX2存在靶向关系，且经双荧光素酶报告实验验证，发现乳腺癌组织中miR-485-3p表达与TPX2 mRNA表达呈负相关，提示miR-485-3p可能通过负调控TPX2参与乳腺癌的发生、发展，但其具体作用机制，有待进一步研究。

综上所述，乳腺癌组织中miR-485-3p低表达、TPX2高表达以及二者异常表达均与患者5年总生存率有关，其有望成为潜在干预乳腺癌治疗策略的靶基因。但miR-485-3p与TPX2的调控关系并未从分子机制上进行探讨，今后需深入分析。