肖淑婷，尹 涛，胡 杨，刘 茹，熊善柏，尤 娟

（华中农业大学食品科学技术学院 长江经济带大宗水生生物产业绿色发展教育部工程研究中心国家大宗淡水鱼加工技术研发分中心（武汉） 武汉 430070）

漂洗是冷冻鱼糜加工过程中的重要工序，可以将鱼肌肉组分中部分脂肪和水溶性组成溶出而除去，进而增大肌原纤维蛋白的浓度，获得富有弹性、白度高、无腥味的鱼糜制品[1-2]。鱼肌肉组分的溶出受到漂洗剂种类和用水量等因素的影响。Hemung 等[3]发现当肌浆蛋白增加到0.5 g 时，会降低肌原纤维蛋白的凝胶性能。李鹏[4]研究漂洗过程中脂肪溶出对鲶鱼鱼糜冷藏条件下脂肪氧化的影响，当残留脂肪含量为10.29 g/100 g 时，鱼糜样品比脂肪更易氧化。由此可以看出在鱼糜漂洗过程中，鱼肌肉各组分的溶出和残留显著影响鱼糜的品质。

臭氧是一种可直接接触食品的高效抑菌剂，目前有报道称一定浓度的臭氧水作为杀菌剂能够延长水产品货架期[5]，改善鱼糜色泽[6]，减少腥味[7]，增强凝胶强度[8]。目前研究主要集中于臭氧氧化作用对于蛋白质的影响[9-10]，而对臭氧漂洗工艺的系统研究较少，且漂洗过程中鱼肌肉组分溶出规律尚不清楚。为了更好地调控臭氧在鱼糜生产中的应用，本试验以白鲢鱼肉为研究对象，分别采用清水、臭氧3 次漂洗，探明臭氧漂洗过程中鱼组分溶出规律，以及对白鲢鱼糜凝胶特性及风味的影响，并分析溶出组分与鱼糜品质间的关系，为臭氧在鱼糜工业生产中的应用提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活白鲢鱼（购于华中农业大学菜市场），每尾重1 000～1 500 g。所有试剂均为分析纯级，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

722 型分光光度计，上海舜宇恒平精密科学仪器有限公司；Bio-Rad 电泳仪，美国伯乐公司；QCQJ-1-3 电解式臭氧气机，武汉威蒙环保科技有限公司；AVANTI J-26 高速冷冻离心机，美国贝克曼公司；FJ-200 高速分散均质机，上海标本模型厂；TA-XTPlus 质构仪，Stable Micro Surrey 英国；FOX40000 电子鼻，法国阿尔法莫斯仪器有限公司；CR-400 色彩色差计，日本柯尼卡美能达。

1.3 试验方法

1.3.1 臭氧水浓度的测定 取10 mL 20%碘化钾溶液和5 mL 3 mol/L 稀硫酸倒入500 mL 三角瓶中，待臭氧发生器运行稳定后量取臭氧水约200 mL，然后立即封口摇匀，静置5 min，用0.005 mol/L 的硫代硫酸钠溶液滴至浅黄色时，加入0.5%淀粉溶液1 mL 继续滴定至无色。记录硫代硫酸钠标准溶液用量，并将滴定结果用空白试验校正。

臭氧计算公式：

式中：CO3——臭氧水质量浓度，mg/L；CNa2S2O3——Na2S2O3浓度，mol/L；VNa2S2O3——滴定消耗Na2S2O3体积，mL；24.00 表示1 mL 1 mol/L Na2S2O3标准溶液相当于24.00 mg 臭氧；V——加入臭氧水体积，L。

1.3.2 鱼糜漂洗与凝胶制备 臭氧水漂洗：取一定量的鱼肉糜加4 倍体积的臭氧水，质量浓度为8 mg/mL，温度4 ℃，将水与鱼肉糜混合，缓慢搅拌10 min，静置5 min 使鱼肉糜充分沉淀，离心脱水，收集漂洗液。

清水漂洗：取一定量的鱼肉糜加4 倍体积的清水，按上述方式进行漂洗。

鱼糜凝胶制备：取定量鱼糜称重，加入一定量的氯化钠（2.5%），斩拌2 min，将鱼糜倒入灌肠机，制得鱼肠。将鱼肠放入40 ℃的水浴锅中1 h，再放入90 ℃水浴锅中30 min，然后流水冷却，放置冰箱4 ℃保藏。

1.3.3 漂洗液中脂肪含量的测定 参照GB 5009.6-2016 《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》[11]。

1.3.4 漂洗液中灰分含量的测定 参照GB 5009.4-2010 《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》[12]。

1.3.5 漂洗液中蛋白质含量的测定 参照Saito[13]的方法，提取水溶性蛋白及盐溶性蛋白，用福林酚法测定蛋白质的含量。

1.3.6 漂洗液的SDS-PAGE 电泳试验参照Morrissry 等[14]对样品进行处理。

1.3.7 鲢鱼鱼糜凝胶测定 将制备好的鱼肠切成25 mm 高的圆柱体，放在质构仪的正下方，质构仪的各项参数如下：测前速1.0 mm/s；测中速度1.1 mm/s；测后速度10.0 mm/s；穿刺距离13 mm；测试探头P/0.25S。

凝胶强度 （g·mm）=破断力 （g）×破断距离（mm）1.3.8 鲢鱼鱼糜凝胶的色度测定 参照Debusca等[15]方法测定鱼糜的色度，白度计算公式如下：

1.3.9 鲢鱼鱼糜凝胶的腥味测定 参照付湘晋等[16]的方法，利用电子鼻测量鱼糜中的不良气味。称取（2.00±0.05）g 漂洗鱼糜于10 mL 顶空中，加盖密封。检测参数：载气，合成干燥空气；载气流速150 mL/min；顶空生产时间120 s；顶空产生温度60 ℃；搅动速度500 r/min；顶空注射体积2.5 mL；顶空注射速度2.5 mL/s；注射针总体积5 mL；注射针温度60 ℃；测试获取时间120 s；延滞时间300 s。

1.4 数据统计与分析

试验重复3 次，每次3 个平行。用Origin 2016 作图。使用SAS 8.0 对采集的数据进行显著性分析、方差分析和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 臭氧漂洗次数对鲢鱼鱼糜组分溶出的影响

2.1.1 臭氧漂洗次数对粗脂肪溶出的影响 传统漂洗脱脂不彻底，鱼肉中的脂肪含量过高时，由于脂肪氧化，容易导致鱼体产生不愉快气味[17]，并且鱼腥味产生与脂质氧化程度具有一致性[18]，而漂洗工艺可以有效去除鱼肉中的粗脂肪，如图1所示，一次漂洗溶出的脂肪含量最多，随着漂洗次数的增加，溶出的粗脂肪含量逐渐减少，漂洗能够有效去除鱼肉中的粗脂肪，李鹏[4]用3 倍体积清水漂洗鲶鱼鱼肉时发现随着漂洗次数的增加，鲶鱼鱼肉中的粗脂肪含量从13.47%降到8.89%，这个结果和Eymard 等[19]对竹荚鱼的研究结果一致，白鲢鱼肉的脂肪含量比鲶鱼和竹荚鱼低，因而漂洗水中溶出的粗脂肪含量不高。此外臭氧一次漂洗溶出的粗脂肪含量明显高于一次清水漂洗 （P＜0.05），3 次漂洗过程中，粗脂肪在臭氧水中的总溶出量大于清水，说明去除相同量的脂肪需要臭氧漂洗的次数和用量更少。

图1 臭氧漂洗次数对粗脂肪溶出的影响Fig.1 Effect of ozone water rinsing times on crude fat dissolution

2.1.2 臭氧漂洗次数对灰分溶出的影响 如图2所示，随着漂洗次数的增加，漂洗液中的灰分含量逐渐减少；一次漂洗溶出的灰分含量与二次、三次漂洗有显著性差异（P＜0.05），而清水漂洗与臭氧漂洗在3 次漂洗中，对于灰分溶出规律无明显差异（P＞0.05），臭氧对鱼肉中的无机盐物质溶出作用不明显。鲢鱼中的粗灰分含量较少，约为1.0%～1.4%[20]，漂洗液中的灰分主要是一些矿物质和无机盐或其它杂质，鱼肉中的灰分含量降低，意味着鱼糜中的离子强度会降低，如Ca2+、Mg2+等，这些离子被认为是蛋白质变性的促进因子[21]，因此，经漂洗过后的鱼糜抗冻剂磷酸盐的添加量可比未漂洗的鱼糜多，不会因为离子强度过强而导致蛋白质易冷冻变性。

图2 臭氧漂洗次数对灰分溶出的影响Fig.2 Effect of ozone water rinsing times on ash dissolution

2.1.3 臭氧漂洗次数对蛋白质溶出的影响 漂洗工艺可以去除鱼肉中的水溶性蛋白，富集更多盐溶性的肌原纤维蛋白[22]，有利于提高鱼糜凝胶强度。由表1可知，随着漂洗次数的增加，漂洗液中的水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量均逐渐减少，一次漂洗时的溶出量远大于二次和三次漂洗 （P＜0.05），Lin 等[23]研究也表明，蛋白质的损失主要发生在第1 次漂洗中，在第2、3 次漂洗中，损失量相对减少。水溶性蛋白质在一次清水漂洗过程中的溶出含量大于一次臭氧漂洗（P＜0.05），二次三次漂洗过程中无明显差异（P＞0.05）盐溶性蛋白质在臭氧漂洗过程中的溶出量明显少于清水漂洗（P＜0.05），因此经过臭氧漂洗的鱼糜，其盐溶性蛋白含量相对较高，Jiang 等[24]的试验也证实了这一点。说明臭氧漂洗对于盐溶性蛋白质有更好的富集作用，提高盐溶性蛋白的相对含量。

鲢鱼水溶性蛋白质的主要分子质量在30～97 ku 之间[25]，从图3中发现，随着漂洗次数的增加，蛋白条带变浅，说明漂洗液中的水溶性蛋白质逐渐减少，这与Gao 等[26]的试验结果一致，而漂洗液中盐溶性蛋白含量较少，主要分布在130～250 ku之间。比较清水漂洗与臭氧漂洗蛋白条带可发现，泳道1、2 分别比泳道4、5 宽且颜色深，说明一次、二次清水漂洗溶出更多的蛋白质，而泳道3 的条带颜色比泳道6 略浅，该趋势与表1一致，然而在表1分析中无明显差异（P＞0.05），但是在电泳中可以看出区别，需要进一步探究。在分子质量28～36 ku 区域，泳道4 条带颜色比泳道1 深，而鱼肉中的组织蛋白酶分子质量在23～30 ku 之间，可知一次臭氧漂洗溶出较多的组织蛋白酶，且组织蛋白酶主要在第一次漂洗中溶出。10 ku 为低分子质量区，在该区域泳道2 有明显条带出现，可能是鲢鱼水溶性的小清蛋白，在清水中易溶出，而在二次臭氧漂洗液中无发现，推测是由于臭氧氧化使其发生聚集，含量减少。

表1 臭氧漂洗次数对漂洗液中蛋白质含量的影响Table 1 Effects of ozone water rinsing on protein content in rinsing solution

图3 臭氧漂洗次数对漂洗液SDS-PAGE 的影响Fig.3 Effect of ozone water rinsing times on SDS-PAGE of rinsing solution

2.2 臭氧漂洗次数对鱼糜凝胶品质的影响

2.2.1 臭氧漂洗次数对鲢鱼鱼糜凝胶性能的影响 鱼糜的凝胶强度是破断强度和凹陷深度的乘积，是评价鱼糜制品品质的重要指标。如图4所示，鱼糜的破断力和凹陷深度还有凝胶强度在一次漂洗后达到最大值，随着漂洗次数的增加，极有可能造成肌原纤维蛋白的损失，影响凝胶强度[27]。经一次漂洗，臭氧处理的鱼糜凝胶强度高于清水漂洗，与李学鹏等[28]所得的用臭氧漂洗处理之后得到的鱼糜凝胶的凝胶强度提高，趋势一致；臭氧漂洗中，一次漂洗所得到的鱼糜凝胶强度最大，显著高于二次漂洗和三次漂洗所得到的鱼糜凝胶（P＜0.05）。在一次臭氧漂洗中，逐渐增加的氧化度促进蛋白质展开、通过二硫键以及疏水相互作用形成的蛋白质聚集增强鱼糜凝胶强度[29]，但随着漂洗次数增加，凝胶强度下降，这是由于多次臭氧水漂洗形成蛋白质聚集体，阻碍凝胶的形成。

图4 臭氧漂洗次数对鲢鱼糜凝胶的破断力（a）、破断距离（b）、凝胶强度（c）的影响Fig.4 Effect of ozone water rinsing times on breaking force （a），breaking distance （b） and gel strength （c）of silver carp surimi gel

2.2.2 臭氧漂洗次数对鲢鱼鱼糜凝胶色度的影响 白度是衡量鱼糜制品品质的重要指标，并直观地影响了消费者的接受程度。由表2可知，随着清水漂洗和臭氧漂洗次数的增加，鱼糜的白度逐渐增加（P＜0.05），大量试验也表明，臭氧水漂洗后的鱼糜白度明显增加[30-31]，与本试验一致，这主要是由于臭氧不仅可以去除大部分水溶性色素，并且其强氧化性能破坏血红素色素的卟啉结构[32]，从而使鱼糜制品白度提高。

表2 臭氧漂洗次数对鲢鱼鱼糜凝胶白度的影响Table 2 Effects of ozone water rinsing times on the whiteness of silver carp surimi gel

2.2.3 臭氧漂洗次数对鲢鱼鱼糜凝胶腥味的影响 根据付湘晋等[16]建立的模型电子鼻中的18 种探头用来检测鱼肉的异味，其中T40-1 探头可以特异性反映土腥味，探头T30/1，T70/2，T40/2 可以特异性的反映哈喇味。土腥味是影响鲢鱼风味最主要的因素之一，主要由土味素导致，如图5所示，随着漂洗次数增加，鱼糜的土腥味变化不显著（P＞0.05），清水漂洗和臭氧水漂洗对鱼糜的土腥味无显著影响（P＞0.05）。薛勇[33]研究也发现臭氧水漂洗处理对鱼肉气味影响不明显，感观评价难以区分新鲜和臭氧水漂洗过的鱼肉，但是臭氧气体漂浮处理对鱼肉气味影响较大。李文协等[34]用不同质量浓度 （0，2，4，6，8，10 mg/L） 臭氧水漂洗鲅鱼鱼糜，发现漂洗处理明显降低了与腥味相关的物质的电子鼻响应值，马海建等[35]研究漂洗过程中白鲢鱼糜风味物质变化，结果表明，漂洗在一定程度上可以除去白鲢鱼糜的腥味。臭氧处理对于鱼糜制品腥味的影响与漂洗的方式、浓度、次数相关，也与风味物质的检测方法相关，因此，臭氧漂洗对于腥味的影响还有待进一步研究。

图5 臭氧漂洗次数对鲢鱼鱼糜凝胶土腥味的影响Fig.5 Effects of ozone water rinsing times on the fishy taste of silver carp surimi gel

不同漂洗方式鱼糜哈喇味探头信号如表3所示，在与哈喇味有关的探头中，T30/1、T70/2 和T40/2 信号值与哈喇味呈正相关性，哈喇味的产生是由于鱼肉中的脂肪氧化所造成的。清水3 次漂洗处理鱼糜，随着漂洗次数的增加，探头T30/1、T70/2、T40/2 的数值呈现先增加后减小的趋势，清水二次漂洗的鱼糜哈喇味最重；臭氧漂洗处理鱼糜时，随着漂洗次数的增加，探头T30/1、T70/2、T40/2 呈现增加的趋势，说明臭氧漂洗次数越多，哈喇味越重；对比清水3 次漂洗得到的鱼糜，臭氧漂洗3 次鱼糜的哈喇味都要高于清水漂洗。这可能是由于高浓度臭氧水对于脂肪的氧化作用剧烈，尽管鱼糜中脂肪含量较低，但是哈喇味的阈值也低，因此产生哈喇味，影响白鲢鱼糜制品风味。

表3 臭氧漂洗次数对鲢鱼鱼糜凝胶哈喇味的影响Table 3 Effects of ozone water rinsing times on the hara taste of silver carp surimi gel

2.3 臭氧漂洗溶出组分与鱼糜凝胶品质的相关性

将白鲢鱼肉臭氧漂洗溶出组分 （粗脂肪、灰分、水溶性蛋白、盐溶性蛋白）与鱼糜品质（破断力、破断距离、凝胶强度、白度、土腥味）进行相关性分析（表4）。结果表明，破断力、破断距离、凝胶强度、白度与水溶性蛋白、盐溶性蛋白之间存在良好的相关性（P＜0.05），其中，水溶性蛋白含量与破断力相关系数最高（r=0.81865，P＜0.05）。白度与水溶性蛋白及盐溶性蛋白含量呈显著负相关（r＜-0.6，P＜0.05）。粗脂肪、灰分、水溶性蛋白、盐溶性蛋白与土腥味之间无显著相关性（P＞0.05）。

表4 臭氧漂洗溶出组分与鱼糜品质之间的相关性分析Table 4 Correlation coefficient r and P value between ozone bleaching components and surimi quality

对破断力、破断距离、凝胶强度、白度分别与水溶性蛋白、盐溶性蛋白作SAS 线性逐步回归分析，得到表5。即鱼糜凝胶的破断力与鱼糜漂洗溶出组分中的水溶性蛋白含量（X1）、盐溶性蛋白含量（X2）满足Y1=304.92684+26.8426X1-240.63914X2，鱼糜凝胶的破断距离（Y2）与鱼糜漂洗溶出组分中的盐溶性蛋白含量（X1）满足Y2=5.52794+0.10508X3，鱼糜凝胶的凝胶强度（Y3）与鱼糜漂洗溶出组分中的水溶性蛋白含量（X1）满足Y3=1 600.73858+110.99775X1，鱼糜凝胶的白度（Y4）与鱼糜漂洗溶出组分中的盐溶性蛋白含量（X2）满足Y4=74.01757-5.47766X2。

表5 鱼糜品质特性与水溶性蛋白、盐溶性蛋白含量的线性回归分析系数Table 5 Coefficient analysis of linear regression analysis between the quality of surimi and the content of water-soluble protein and salt-soluble protein

3 结论

臭氧漂洗过程中鱼肉组分溶出规律与鱼糜品质变化存在一定的关联性。凝胶强度与水溶性蛋白溶出量呈显著的正相关性（r＞0.8，P＜0.0001），肌原纤维蛋白通过蛋白质之间的相互作用而形成三维黏弹性凝胶矩阵，因此当臭氧漂洗溶出较多水溶性蛋白，增加盐溶性蛋白的相对含量时，能够有效提升鱼糜制品的凝胶强度。鱼糜凝胶白度与盐溶性蛋白含量呈现负相关性（r=-0.73242，P＜0.05），说明鱼糜凝胶白度与鱼肉中盐溶性蛋白含量呈正相关，有研究指出，水分含量越高，凝胶亮度越高[28]，这可能是盐溶性蛋白形成凝胶，从而保留更多水分。粗脂肪、灰分、水溶性蛋白、盐溶性蛋白与土腥味之间无显著相关性（P＞0.05），但是很多试验表明臭氧漂洗可以去除鱼肉腥味，臭氧水对鱼肉的脱腥作用可能是臭氧水的强氧化性对于风味物质的直接分解作用，因此与粗脂肪、灰分、水溶性及盐溶性蛋白含量无明显的相关性，为了验证臭氧的脱腥机理，下一步可以研究漂洗后风味前体物质，如氨基酸、核苷酸、小肽等的变化趋势，探究臭氧对该类物质的影响及其最终风味的差别。