李颖畅，赵 楠，李园园，宋素珍，2，仪淑敏，沈 琳，励建荣*

（1 渤海大学食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心 辽宁锦州 121013 2 大连工业大学 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心 辽宁大连 116034 3 大连东霖食品股份有限公司 辽宁大连 116101）

氧化三甲胺 （trimetlylamine oxide，TMAO）在鱿鱼等海产品中含量丰富，它参与水生动物渗透压的调节，是一种鲜味物质，同时也是海产品产生甲醛的前体物质[1-2]。鱿鱼鱼糜低温贮藏过程中，TMAO 在氧化三甲胺脱甲基酶 （Trimethylamine-N-oxide demethylation，TMAOase） 的作用下产生甲醛（FA）、二甲胺（DMA）、三甲胺（TMA）[3]。FA 与蛋白质中游离的氨基发生反应，导致蛋白质交联，蛋白溶解度下降，同时降低鱼肉蛋白的胶凝能力[4-5]。李颖畅等[6]研究表明，FA 使肌原纤维蛋白凝胶的持水性和凝胶强度降低；此外，FA 诱导鱼肉蛋白结构的改变，导致鱼肉蛋白特性改变，影响产品品质。Careche 等[7]以鳕鱼肌原纤维蛋白为研究对象，通过拉曼色谱仪监测贮藏和冷冻过程中鳕鱼肌肉蛋白的变化，结果表明加入FA 后鳕鱼蛋白质构象发生改变；Fu 等[8]发现FA 诱导鱿鱼胶原蛋白结构改变；Hultin 等[9]研究表明FA 使肌球蛋白变性，提取率降低。抑制鱿鱼中甲醛产生和保持蛋白质的功能特性，对鱿鱼加工产业的发展具有重要意义。李颖畅等[10]研究表明蓝莓叶多酚单体化合物（绿原酸、槲皮素-3-D-半乳糖苷）与FA 发生酚醛缩合反应，从而使FA 含量降低。俞其林等[11]研究了儿茶素与FA 的反应特性，研究结果表明其发生酚醛缩合反应。李颖畅等[12]通过在鱼丸制品中添加蓝莓叶多酚来抑制鱼丸中的甲醛；Dong 等[13]在干制鱿鱼产品中添加茶多酚来控制产品中甲醛含量。

肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）在鱼肉蛋白质中占有较高比例，是形成鱼糜的主要成分，通常能够形成凝胶网络，并通过包裹水分来提高保水能力[14]。在贮藏过程中因甲醛的影响而使蛋白的功能特性部分降低或损失，从而影响鱼肉制品的品质。目前关于儿茶素对贮藏过程鱿鱼肌原纤维蛋白功能特性的影响还未见报道。本文以绞碎的阿根廷鱿鱼胴体为原料，向其中添加TMAOase，构建鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系，通过测定鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系色差、持水性、MP 溶解性、浊度、粒径、电位、流变特性等指标的变化，探究儿茶素对鱿鱼MP 功能的影响，为抑制鱿鱼中的甲醛含量，保持鱿鱼鱼糜品质提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱿鱼，辽宁省锦州市水产市场；TMAOase，由阿根廷鱿鱼肝脏中纯化所得；儿茶素（≥98%），北京索莱宝科技有限公司；硫酸铜，洛阳氚珅化工仪器有限公司。

1.2 仪器与设备

CR-4000-P100 色差仪，日本Konica Minolta公司；UV-2550 紫外-可见分光光度计，岛津仪器有限公司；TA.XT-plus 质构仪，Stable Micro Systems 公司；MS105DU 电子分析天平，METTLER TOLEDO 公司；90 Plus zeta 电位仪，美国Brookhaven仪器有限公司；THERMO X1R 冷冻高速离心机，美国Thermo 公司；XLJ001 多功能绞肉机，九阳股份有限公司；HH-6 恒温水浴锅，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理 阿根廷鱿鱼用流水解冻，去头、内脏。将鱼肉切碎，分成若干等份（每份100 g）。每份与纯化的TMAOase 混合 （700 U/g 切碎的鱼肉），在搅拌机中搅拌混匀60 s，加入不同浓度的儿茶素，混匀。最终混合体系中儿茶素的浓度为0，20，40，60，80，100 μmol/g。试验分为7 组：A 组：肌肉-TMAOase；B 组：肌肉；C 组：肌肉-TMAOase-20 μmol/g 儿茶素；D 组：肌肉-TMAOase-40 μmol/g儿茶素；E 组：肌肉-TMAOase-60 μmol/g 儿茶素；F 组：肌肉-TMAOase-80 μmol/g 儿茶素；G 组：肌肉-TMAOase-100 μmol/g 儿茶素。在0 ℃贮藏6 d后测定所有组别的相关指标。

1.3.2 FA、DMA、TMA、TMAO 的测定 根据Rehbein 等[15]的方法测定FA 含量；二甲胺（DMA）和三甲胺（TMA）的测定根据贾佳[16]的方法。

三甲胺的测定：取4 mL 溶液加入1 mL 10%甲醛，5 mL 甲苯和3 mL 25% KOH，在30 ℃的水浴中加热5 min，将0.2 g 无水硫酸钠加入到4 mL甲苯层中去水，取2 mL 无水甲苯层加入2 mL 苦味酸，在410 nm 处测定吸光度得到三甲胺的含量。

氧化三甲胺（TMAO）的测定：取4 mL 经处理的阿根廷鱿鱼上清液，加入0.50 mL 1% TiCl3溶液，混匀，于80 ℃水浴锅中加热90 s，冷水冷却，其它步骤与TMA 测定步骤相同。氧化三甲胺计算公式如下：

式中，A0——阿根廷鱿鱼样品中TMAO 的含量，mg/kg；A1——经TiCl3溶液还原后的TMA 含量，mg/kg；A2——阿根廷鱿鱼样品中TMA 的含量，mg/kg；79.11——TMAO 的相对分子质量；59.11——TMA 的相对分子质量。

1.3.3 色差的测定 各处理组的L*、a*和b*值用色差计测定。白度指数（WI）按下列公式计算：

1.3.4 持水性的测定 称取6 g 样品，3 000×g 离心5 min。去除离心出的水分，称量其质量。按下列公式计算各试验组的持水性。

式中，m1——离心管和离心去水后的碎肉质量，g；m2——离心管和未离心去水的碎肉质量，g；m0——离心管质量，g。

1.3.5 肌原纤维蛋白的提取和溶解度的测定 肌原纤维蛋白的提取和溶解度的测定参考Bertram等[17]的方法。

1.3.6 肌原纤维蛋白粒径的测定 粒径的测定参考Chen 等[18]的方法。

1.3.7 肌原纤维蛋白电位的测定 参考Chen 等[19]的方法。采用90 Plus zeta 电位分析仪测定MP 溶液的Zeta 电位。测定条件为：温度25 ℃，温度平衡时间2 min，每个样品重复测量6 次，取平均值。

1.3.8 肌原纤维蛋白浊度的测定 参考冷利萍[20]的方法。

1.3.9 肌原纤维蛋白胶凝能力的测定 胶凝能力的测定参考Sun 等[21]的方法。

1.3.10 肌原纤维蛋白凝胶强度的测定 凝胶的制备：将提取的MP 蛋白质量浓度调到90 mg/mL，置凝胶小瓶中，搅拌均匀，无气泡后，放入水浴锅中，以1 ℃/min 的速率升至90 ℃，保温30 min，然后取出凝胶小瓶，用冰水迅速冷却至室温，4 ℃保存12 h 后测定凝胶强度。

凝胶强度的测定：取制好的凝胶样品，在室温平衡30 min 后切成2.5 cm×2.5 cm 的圆柱体。用质构仪测定各处理组凝胶的破断力和凹陷距离。测定条件：探头：P/5S 球形金属探头；测前速度：2.0 mm/s，测中速度：1.0 mm/s，测后速度：1.0 mm/s；测试距离：15.0 mm；触发力：10.0 g。

1.3.11 数据分析 分别采用 Orign 8.5 和SPSS19.0 作图并进行方差分析，P＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 体系中FA、DMA、TMAO 含量的影响

由图1a、1b 可知，B 组（肌肉）的FA、DMA 含量显著低于A 组（肌肉-TMAOase）（P＜0.05）。由图1c 可知，B 组（肌肉）的TMAO 含量显著高于A 组（肌肉-TMAOase）（P＜0.05）。这表明TMAOase 使鱿鱼体内的TMAO 分解，FA、DMA 含量升高。随着儿茶素浓度的增加，鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系中FA、DMA 含量显著降低（P＜0.05），TMAO 含量显著增加（P＜0.05）。这表明儿茶素抑制TMAO 的分解和FA 的产生，且儿茶素对TMAO 的分解具有浓度依赖性。这可能有两方面的原因：一是儿茶素与TMAOase 发生相互作用，导致TMAOase 活性被抑制，TMAO 的催化速率降低，FA 和DMA 含量降低；二是儿茶素与FA 发生酚醛缩合反应，导致甲醛含量的减少[22-23]。

图1 儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 体系中TMAO 分解的影响Fig.1 Effects of （+）-catechin on TMAO decomposition in squid muscle-TMAOase system

2.2 儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系色差的影响

色泽是评价鱿鱼新鲜度和品质的重要特征[24]。白度值是鱿鱼色泽L*、a*、b*值的综合评价指标，可间接反映鱿鱼的色泽和品质[25]。不同浓度儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系色泽的影响见表1。A（肌肉-TMAOase）和B（肌肉）处理组的L*、a*、b*和白度值无显著性差异（P＞0.05），表明添加TMAOase 不影响鱿鱼的色泽。C-G 为添加儿茶素的处理组，结果显示，随着儿茶素浓度的增加，鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系的a*和b*无显著性差异（P＞0.05），L*和白度值呈上升趋势，且当儿茶素浓度为100 μmol/g（G 组）时，显著高于C、D、E 和F 组，表明儿茶素对鱿鱼肉的色泽有保护作用。黄健安等[26]以鸭肉为研究对象，儿茶素对鸭肉的色泽也有保护作用。本研究结果与其一致。

表1 儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系色泽的影响Table 1 Effects of （+）-catechin on the color of squid muscle-TMAOase system

2.3 儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系持水性的影响

持水性与肉制品的硬度、质地、颜色有着密切的联系，是影响肉类品质和经济价值的重要因素之一[27]。儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系持水性的影响如图2所示。B 组（肌肉）的持水性为86.31%，而A 组（肌肉-TMAOase）的持水性显著降低（P＜0.05）。这主要是因为A 组TMAOase 存在下产生较高含量的甲醛，与鱿鱼肉蛋白结合，破坏鱼肉蛋白的稳定结构，使蛋白疏松，持水性降低。当儿茶素添加量在20～60 μmol/g 时，随着儿茶素浓度的增加，鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系的持水性显著增加（P＜0.05），推测可能是儿茶素分子上的羟基与鱼肉蛋白较好地结合，更多的水分被截留。当儿茶素添加量增到80 μmol/g 和100 μmol/g 时，鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系的持水性显著降低，仍显著高于A 组的持水性。这可能是由于儿茶素浓度过大，与蛋白质间相互作用形成的混合体系与其它成分交叉连接增多，导致大颗粒的形成和难溶物质的凝集，这种聚集现象导致蛋白质分子间接触频率减少，使蛋白质网络结构断裂，锁水能力下降[28-29]，说明并非儿茶素浓度越高，持水性越好。

图2 儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 体系持水性的影响Fig.2 Effects of （+）-catechins on water holding capacity of squid muscle-TMAOase system

2.4 儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系中肌原纤维蛋白溶解性的影响

溶解性是蛋白质重要的物理指标之一，也是反映蛋白质功能特性的重要因素之一。不同浓度儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系溶解性的影响见图3。B 组（肌肉）MP 的溶解度为91%，与B组相比，A 组（肌肉-TMAOase）MP 的溶解度显著降低 （P＜0.05）。这是由于在TMAOase 存在条件下，A 组鱿鱼肌肉中含有一定量FA，FA 与鱼肉蛋白质中肽类、氨基酸残基等各种小分子质量物质反应，导致蛋白质分子间和分子内交联，使蛋白溶解度下降。Sikorski 等[30]报道FA 与蛋白发生反应，导致构象发生改变，蛋白质的溶解性下降。本研究结果与其一致。当儿茶素添加量为20，40，60 μmol/g 时，随着儿茶素浓度的增加MP 溶解性显著增加（P＜0.05），儿茶素添加量为80 μmol/g 与40 μmol/g 的两组溶解性差异不显著（P＞0.05）。儿茶素浓度继续增加，溶解性略微降低。这可能是由于低浓度的儿茶素减少肌原纤维蛋白疏水性基团的暴露，使表面疏水性降低，溶解性升高；高浓度的儿茶素促进位于蛋白质核心的疏水性氨基酸的暴露，MP 表面上的蛋白质与水之间的相互作用减少，蛋白质的不稳定性增加，溶解性降低[31]。添加儿茶素的各处理组溶解度明显高于未添加儿茶素的处理组，说明儿茶素可抑制甲醛的产生。在一定浓度范围，儿茶素也有增加MP 溶解度的作用，使MP 品质保持良好。

图3 儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 体系中肌原纤维蛋白溶解性的影响Fig.3 Effects of （+）-catechins on solubility of myofibrillar protein in squid muscle-TMAOase system

2.5 儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系中肌原纤维蛋白粒径的影响

蛋白质的粒度分布可直观反映蛋白的聚集和降解情况，也是评价蛋白功能特性的重要指标[32]。不同浓度的儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系肌原纤维蛋白粒径的影响如图4所示，内插表为不同处理组的平均粒径。结合内插表可知，与各处理相比，A 组（肌肉-TMAOase）的粒径分布向粒径大的方向移动，且A 组的平均粒径为641.9 nm，显著高于其它处理组 （P＜0.05）。说明只添加TMAOase 的处理组MP 发生聚集，导致粒径较大。这是由于TMAOase 催化产生的FA 诱导MP 疏水氨基酸侧链基团的共价连接，促进了蛋白的聚集[33]。C-G 组为添加不同浓度儿茶素的处理组，加入儿茶素后，随着浓度的增加，鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系中的粒径呈先降后升的趋势，当儿茶素浓度为60 μmol/g 时，平均粒径最小，为508 nm。这一结果与溶解性的一致。当溶解性高时，粒径较小；当溶解度较低时，粒径较大。60 μmol/g 儿茶素是最适宜的添加量，不仅可以抑制TMAOase，还可以更好地保持蛋白的功能特性。

图4 儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 体系中肌原纤维蛋白粒径的影响Fig.4 Effects of （+）-catechins on particle size distribution of myofibrillar protein in squid muscle-TMAOase system

2.6 儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系中肌原纤维蛋白电位的影响

不同浓度儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系肌原纤维蛋白溶液电位的影响如图5所示。所有处理组的电位都为负值，这主要是由于鱿鱼蛋白中含有丰富酸性氨基酸，在中性pH 值下大部分去质子化。B 组（肌肉）的电位值（绝对值）显著高于A 组（肌肉-TMAOase）（P＜0.05），说明A 组的蛋白发生聚集，掩盖残留在蛋白质复合物中的带电氨基酸[34]，因此电位值降低。C-G 为添加了儿茶素的处理组，结果显示，C-G 组的电位值显著高于A、B 两组（P＜0.05），并且随着儿茶素浓度的增大，鱿鱼肌肉-TMAOase 体系电位呈先升高后降低的趋势。可能是低浓度的儿茶素与纤维蛋白作用，抑制蛋白的聚集，蛋白体系更加稳定，电位值升高。

图5 儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 体系中肌原纤维蛋白电位的影响Fig.5 Effects of （+）-catechins on the Zeta-potetials of myofibrillar protein in squid muscle-TMAOase system

2.7 儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系中肌原纤维蛋白浊度的影响

浊度反映蛋白的聚集程度，也是形成良好凝胶的前体条件。当浊度较大时，表明蛋白悬浮颗粒大，蛋白发生聚集；当浊度小时，表明蛋白悬浮颗粒小，蛋白分散均匀[35]。不同浓度儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 体系浊度的影响如图6所示。与B组（肌肉）相比，A 组（肌肉-TMAOase）的浊度显著升高（P＜0.05）。C-G 组为添加不同浓度儿茶素的处理组，随着儿茶素浓度的增加，鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系中蛋白的浊度呈先降后升的趋势，儿茶素浓度为60 μmol/g 时浊度最低，蛋白溶液最清澈，其变化趋势与溶解度一致。溶解度越大，浊度越小。

图6 儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 体系中肌原纤维蛋白浊度的影响Fig.6 Effects of （+）-catechins on the turbidity of myofibrillar protein in squid muscle-TMAOase system

2.8 儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系中肌原纤维蛋白胶凝能力的影响

肌原纤维的胶凝能力是用来表征肌原纤维蛋白在形成凝胶的过程中弹性和黏性的变化，决定蛋白的功能特性。不同浓度的儿茶素处理鱿鱼肌肉-TMAOase 体系的肌原纤维蛋白，在形成热凝胶过程中动态黏弹流变性的变化如图7所示。在温度低于37 ℃时，肌原纤维蛋白的储能模量（G'）随温度的升高而降低。这是由于低温阶段氢键是主要作用力，随着温度的升高，氢键作用减弱，储能模量（G'）降低。在37～45 ℃范围内G'随着温度的升高而升高并达到峰值，表明肌原纤维蛋白开始变性，凝胶开始形成。此时，峰值对应的温度为变性温度。在45～55 ℃范围，G'随温度的升高而下降，这一阶段为凝胶裂化阶段，可能是由于蛋白质从双螺旋结构转变为无规则卷曲结构时破坏了蛋白质的网络结构，造成储能模量G' 的下降[36]。温度升到70 ℃后，储能模量G' 随温度的升高而升高或趋于平缓升高，此阶段是因为绝大多数的蛋白质分子展开，肌原纤维蛋白的交联程度增加，凝胶网络结构增强，最终形成不可逆的热诱导凝胶。

45 ℃时，阿根廷鱿鱼肌原纤维蛋白的储能模量G'，随儿茶素浓度的增加，呈现先增后减的趋势。当儿茶素浓度60 μmol/g 时达到最大值。当儿茶素浓度为80 μmol/g 和100 μmol/g 时，G' 开始降低。这说明低浓度的儿茶素有助于肌原纤维蛋白形成良好的凝胶网络结构，高浓度的儿茶素可能与MP 结合过度，MP 的结构被破坏，同时MP中的氨基、巯基等官能团被屏蔽，阻碍其形成有序的蛋白质凝胶网络，导致MP 的凝胶性能降低[37-38]。A 组的（肌肉-TMAOase）的储能模量G' 低于各处理组，说明FA 对MP 的胶凝能力有负面影响。

损耗模量G'' 随温度的变化趋势同储能模量G' 的一致，G'' 始终小于G'，表明弹性性能始终优于黏性性能。与文献报道的一致。Jia 等[31]报道在猪肉的肌原纤维蛋白中添加低浓度的儿茶素会增强肌原纤维蛋白的胶凝能力，较高浓度的儿茶素会降低蛋白质形成凝胶的能力。Cao 等[39]研究表明高浓度的EGCG 抑制MP 的乳化和凝胶的形成，低浓度的EGCG 可改善肉糜的氧化稳定性，而不会损害其质地的稳定性。

2.9 儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系中肌原纤维蛋白凝胶强度的影响

不同浓度的儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系中肌原纤维蛋白凝胶强度的影响如图8所示。B 组（肌肉）MP 的凝胶强度显著高于A 组（肌肉-TMAOase）（P＜0.05）。这是因为A 组产生较高的甲醛，高含量的甲醛破坏了肌原纤维蛋白变性，凝胶强度降低。李颖畅等[40]报道甲醛含量的增加使肌原纤维蛋白凝胶的破断力增加。C-G 为添加儿茶素的处理组，结果显示，随着添加儿茶素浓度的增加，鱿鱼肌肉-TMAOase 模拟体系中凝胶强度呈先显著增加（P＜0.05）后显著降低的趋势（P＜0.05）。当儿茶素浓度为60 μmol/g 时，凝胶强度最大。这是由于儿茶素的酚羟基被氧化成醌类物质，与肌原纤维蛋白的巯基发生共价作用形成更稳定的构象，促使蛋白中的巯基向二硫键转化，凝胶强度增强；当儿茶素浓度过高时，儿茶素与肌原纤维蛋白共价结合过度，肌原纤维蛋白的结构被破坏，导致蛋白发生不良聚集，凝胶强度降低[41-42]。Cao等[39]研究发现中、低浓度的绿原酸能够促进猪肉肌原纤维蛋白的胶凝化，高浓度的绿原酸（150 μmol/g 蛋白）明显抑制蛋白的胶凝过程，导致凝胶强度降低。

图8 儿茶素对鱿鱼肌肉-TMAOase 体系中肌原纤维蛋白凝胶强度的影响Fig.8 Effects of （+）-catechins on gel strength of myofibrillar protein in squid muscle-TMAOase system

3 结论

1） 鱿鱼贮藏过程中产生的FA 导致鱿鱼MP的溶解性降低，浊度升高，粒径增大，胶凝性能降低。儿茶素对鱿鱼体内TMAO 催化有抑制作用，可显著降低FA、DMA 含量。

2） 随着儿茶素的增加，鱿鱼MP 的溶解性、浊度、粒径、zata 电位值、胶凝能力和凝胶强度均呈先升后降的趋势，表明低浓度的儿茶素（20，40，60 μmol/g） 对鱿鱼肌原纤维蛋白的功能特性有促进作用，高浓度的儿茶素（80，100 μmol/g）对肌原纤维蛋白的功能特性具有抑制作用。儿茶素对鱿鱼的色泽具有保护作用。鱿鱼低温贮藏期间最适宜的儿茶素添加量为60 μmol/g。