李 媛，傅玉颖，李泽亚，张 超，李贞鹏，苏欢欢

（浙江工商大学食品与生物工程学院 杭州 310018）

β-胡萝卜素（beta-carotene，BC）是一种常见的类胡萝卜素，具有多种功能，如抗氧化作用，调节机体免疫系统，防癌作用，合成维生素A 等[1-2]。由于BC 含有多个共轭双键，使得其对光、热、氧极其敏感[3-4]；同时BC 水溶性极低，仅微溶于油和部分有机溶剂[5]，这极大地限制了其在食品中的应用。为解决以上问题，人们做了大量研究，如制备微胶囊、固体脂质纳米颗粒、纳米乳液、β-环糊精包合物等运载体系来提高BC 的稳定性和溶解度。近年来，有研究利用与蛋白（如酪蛋白[6]、β-乳球蛋白[7]）的络合作用来提高BC 在水溶液中的溶解度、稳定性以及生物利用率。这种包埋体系不需要添加油相，制备简单，无需添加合成乳化剂，具有添加到无脂饮料中的潜力。

乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI）是奶酪生产过程中重要的副产品，因其较高的营养价值、低廉的价格以及多种功能特性（如乳化、增稠、凝胶），故可作为生物活性物质的载体[8]。WPI在pH 2 条件下加热（80 ℃）数小时，可以自组装形成淀粉样蛋白原纤维。乳清分离蛋白纤维（whey protein nanofibrils，WPN） 具有约10 nm 的直径，几微米的长度，这种较高长度直径比值的纤维结构赋予了蛋白原纤维独特的流变特性，较强的胶凝能力、乳化性和起泡性[9]。与天然的WPI 相比，WPN 具有更好的两亲性、发泡性能以及更高的耐热性[10]。有研究表明WPN 可作为微胶囊的壁材和乳化剂，对一些活性物质封装和保护。Mehdi等[11]将WPN 用作包埋姜黄素的载体，使得姜黄素的水溶性大大增加，与WPI 相比，姜黄素从WPN中释放的更慢，从而具有缓释作用。Zhang 等[12]通过微波加热WPI 形成WPN，WPN 作为乳化剂制备的乳液具有更好的稳定性。

为进一步增强蛋白包埋体系的稳定性，可在蛋白外面附加一层多糖，多糖通过静电作用与蛋白复合，进而增加复合物间的空间位阻和静电排斥力[13]。菊粉是一种线性直链阴离子多糖[14]，作为一种功能性多糖，不仅具有益生元功效，还可作为脂肪代替物与糖类代替物应用于食品中[15]。有研究以菊粉和大豆分离蛋白作为壁材，可提高鱼油的包封率[16]。透明质酸是一种线性糖胺聚糖的天然聚合物，属于阴离子多糖，对蛋白质的空间构型和功能具有一定调节作用，例如：HA 可附着到蛋白纤维网中，填充空隙[17]。本文将WPI 溶液在酸性条件下加热（pH=2，80 ℃）24 h 获得WPN，基于反溶剂沉淀法将这些WPN 与BC 在pH=3.2 下复合制备WPN/BC 复合粒子，进一步添加Inu 和HA获得WPN/Inu/BC 和WPN/HA/BC 复合粒子。通过荧光猝灭和傅里叶红外光谱确定WPN 多糖复合物与BC 之间相互作用和结构特征。使用多种技术确定分散体系的稳定性，并测定BC 包封效率。此外，根据复合粒子的抗氧化活性（DPPH 清除活性） 和BC 的体外释放行为对其复合粒子的功能特性进行评估。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清分离蛋白（＞95%），美国DAVISCO 公司；β-胡萝卜素（≥96%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；透明质酸（食品级），嘉兴恒杰生物制药股份有限公司；天然菊粉（PD 2-60），维乐夫集团有限公司等。

1.2 仪器与设备

Nicolet iS5 傅里叶变换红外光谱，上海力晶科学仪器有限公司；F-7000 荧光分光光度计，日本HITACHI 公司；Zeta sizer Nano ZS 激光粒度分析仪，英国Malvern 公司；UV-2600 紫外可见分光光度计，日本岛津仪器有限公司；H1850R 高速冷动离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Re-5220 真空旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

1.3 WPN/多糖/BC 复合物的制备

根据Akkermans 等[18]所述的方法并稍作修改，将乳清分离蛋白原纤化。在室温下将乳清分离蛋白粉末溶解在去离子水中通过磁力搅拌2 h，然后在4 ℃下放置12 h 制备WPI 储备溶液（质量分数2%）。用6 mol/L HCl 将蛋白溶液的pH 值调节至2，然后在温和的搅拌条件下于85 ℃加热24 h，得到WPN 溶液之后，立即使用冰浴将WPN 溶液冷却至室温。将所得原纤化的WPN 溶液4 ℃储存或-20 ℃冷冻干燥备用。

制备质量分数0.1%的BC 溶液：称取BC 溶于无水乙醇加热搅拌半小时。

用2 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl 将质量浓度为20 mg/mL 的WPN 溶液pH 值调整为3.2，模拟酸性食品饮料的条件，之后将BC 用注射器注入pH 3.2 的WPN 溶液中，在50 ℃的水浴中以1 000 r/min 的磁力搅拌2 h。40 ℃条件下用真空旋转蒸发仪除去乙醇，然后加入相同体积的去离子水。将它们分为三等分，分别以4∶1（体积比）的比例加入去离子水，1.5%天然Inu 溶液和0.02% HA 溶液，在室温下将它们在1 000 r/min 磁力搅拌混合2 h。混合物中BC 的终质量浓度为0.16 mg/mL，加入一定量的0.02% NaN3，在4 ℃下保存或冷冻干燥以备后用。

1.4 Zeta 电位测量

用激光粒度分析仪测定pH 值为3.2 的WPN，WPN/Inu，WPN/HA 及其与BC 的配合物等不同样品溶液的Zeta 电位。样品用蒸馏水（pH 3.2）稀释，所有样品均在（25±1）℃下进行测量，一式3 份。

1.5 荧光光谱测定

通过Sun 等[19]的方法，设定激发波长为280 nm，发射光谱在300 和450 nm 之间收集，扫描速度为100 nm/min。在将样品稀释几倍后，测量蛋白质的固有荧光。

1.6 傅里叶变换红外光谱测定

将冻干固体样品（BC，WPN，Inu，HA，WPN/BC，WPN/Inu，WPN/HA，WPN/HA/BC，WPN/Inu/BC）与溴化钾以1∶100 的质量比例加入研钵中，在红外灯照射下研磨成粉末状，取适量样品用压片机制成薄片置于衰减全反射的样品槽中进行测定分析，光谱分辨率为4 cm-1，扫描波长为400～4 000 cm-1，扫描32 次。

1.7 粒子包封率测定

将1 mL WPN/BC，WPN/Inu/BC 和WPN/HA/BC 复合物以及3 mL 正己烷的样品放入离心管中进行混合。涡旋振荡60 s 后，将样品放入离心机中。在10 000 r/min 条件下离心20 min，取上清液定容于10 mL 棕色容量瓶中，根据下式（1）计算包封率：

1.8 DPPH 自由基清除活性测定

参照Guan 等[20]方法，对其稍作修改，使用稳定的自由基DPPH 测试包封BC 复合物的自由基清除活性。配制0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液，将3 mL DPPH 溶液与1 mL 含/不含BC 的样品溶液（即WPN，WPN/Inu，WPN/HA，WPN/BC，WPN/Inu/BC 和WPN/HA/BC）混合，置于室温（25 ℃）下于黑暗中孵育30 min，然后使用分光光度计测量517 nm 处的吸光度。用去离子水（pH 3.2）作为空白对照。DPPH 自由基清除活性的计算如下[21]（2）或（3）：

式中：Ai——BC 与DPPH 溶液混合的样品溶液的吸光度值；Aj——BC 与乙醇溶液混合后的样品溶液的吸光度值；Ac——蛋白质溶液与DPPH溶液的吸光度值；A0——空白的吸光度值。

1.9 BC 稳定性测定

将WPN/BC，WPN/Inu/BC，WPN/HA/BC 复 合物在室温轻微搅拌下孵育15 d，确定其化学稳定性。通过在整个存储期内定期分析其浓度来确定BC 降解的程度，使用溶剂萃取从纳米复合物中分离出BC，然后使用UV-可见光谱法对其进行定量[22]。加入每个样品（0.2 mL）后，在10 s 的涡旋下加入含有乙醇和正己烷（体积比为2∶3）的溶剂。将混合物静置几分钟直到发生完全的相分离，然后将上面的黄色上清液（己烷相）转移到10 mL 容量瓶中。用1 mL 正己烷重复萃取几次，直到乙醇相变为无色。对每个样品进行3 次重复分析，并使用分光光度计在452 nm 处测量吸光度。纯正己烷溶液用作空白，通过参考在相同条件下制备的标准曲线获得BC 浓度。保留率表示为BC 质量浓度百分比：Ct/C0（%），其中Ct是储存一段时间后的BC 质量浓度，C0是初始BC 质量浓度。BC 的降解符合一级动力学模型[23]，可由方程（4）计算降解率k，再由公式（5）计算BC 半衰期IC50即BC 降解50%所需的时间[24-25]。

式中：t——保存时间，d；k——降解速率常数，d-1；A0——适应常数。

1.10 体外模拟消化试验

试验根据Chen 等[26]的方法进行了一些修改，将30 mL 样品与30 mL 含3.2 mg/mL 胃蛋白酶的模拟胃液（SGF）混合，用盐酸将pH 调节至3，然后置于37 ℃的水浴中连续搅拌2 h 模拟胃消化。将从上述模拟胃相中获得的20 mL 样品与20 mL包含1.6 mg/mL 胰腺的模拟肠液（SIF）混合，将pH值调节至7.0，置于37 ℃水浴连续搅拌2 h 模拟小肠消化。分别在第10，30，60，90，120，150，180，210，240 min 吸取3 mL（分为3 个平行试验）溶液离心后测BC 浓度。模拟消化液成分表如下[27]：

表1 模拟消化液原液的制备成分表Table 1 Preparation of simulated digestive stock solution

1.11 统计分析

使用单向方差分析（ANOVA）进行数据的统计分析，并使用SPSS 软件（第20 版，IBM 软件，纽约州，美国）通过邓肯多范围分析程序确定样品之间的显著差异（P＜0.05）。每个试验至少重复3 次。

2 结果与分析

2.1 Zeta 电位

测量ζ 电位以反映在水溶性递送系统中分散体的稳定性。如图1所示，在pH 3.2 下，纯Inu 的Zeta 电位为（-7.68±1）mV，HA 为（-5.9±1.28）mV。与WPN（+40.27 mV±2.01 mV）相比，WPN 复合材料Inu 和HA 的电势分别为 （+38.23±2.83）mV 和（+34.43±1.45）mV，所带电荷略微下降。

当添加BC 时，WPN/BC，WPN/HA/BC 和WPN/Inu/BC 的Zeta 电位分别为（+52.1±0.52）mV，（+44.83±0.8）mV 和（+48.27±0.65）mV。在蛋白和多糖复合物的形成的过程中静电相互作用对体系的稳定起着重要作用，在pH=3.2 环境下WPN 带正电，而多糖带负电，因此，ζ 电位值的变化表明WPN 和阴离子多糖通过静电吸引导致阴离子多糖在乳清蛋白表面被覆，从而屏蔽了表面电荷。此外，HA 具有很大的空间位阻作用[28]，赋予WPN/HA/BC 良好的稳定性。

由图1可以看出胶体分散体系仍带正电荷，这表明WPN 在复合纳米颗粒外层的主要部分。然而外层的总ζ 电位下降，表明阴离子多糖在蛋白纤维网的间隙中附着，这使保护BC 的外层变得更加紧密，更好地保护BC。

图1 HA，Inu 以及复合物的Zeta 电位图Fig.1 Zeta potential diagram of HA，Inu and complexes

2.2 荧光光谱

荧光猝灭法可以用来研究多糖Inu 和HA 对WPN 疏水氨基酸微环境的影响以及负载BC 后WPN 构象的变化。由图2可知激发波长为280 nm 时Trp 和Tyr 残基被激发，这主要依赖于蛋白的折叠和展开。WPN 的Trp 和Tyr 残基激发后在341 nm 处显示出最大荧光发射峰，添加Inu 和HA后最大峰值没有发生变化说明Trp 和Tyr 的微环境没有发生改变，但WPN 荧光强度略有增加，说明WPN 暴露出更多的疏水氨基酸，这可能是由于多糖与WPN 亲水基团结合，进而改变了纤维蛋白的结构。当WPN 和WPN 多糖负载BC 后荧光强度略有下降，说明WPN 发生荧光猝灭反应（主要是复合物形成引起的静态淬灭[31]），可能是由于BC 与WPN 的疏水氨基酸相互作用，使得暴露在外的疏水基团减少。

图2 WPN，WPN/多糖以及WPN/多糖/BC 的荧光图谱Fig.2 Fluorescence diagram of WPN，WPN/polysaccharide and WPN/polysaccharide/BC

2.3 FTIR

图3所示为多糖，WPN 以及负载BC 纳米粒子的红外光谱图。菊粉骨架特征吸收峰位于933，1 030，3 411 cm-1处[29]。透明质酸的特定峰处于3 420～3 280 cm-1，该峰属于-COOH 和-OH 的拉伸振动，在2 916 cm-1处的峰属于-CH 拉伸振动。此外，在1 621 和1 415 cm-1处的峰是归因于COO-基团对称和不对称振动的拉伸振动，而在1 322 cm-1处的峰是由HA 的N-H 拉伸振动引起[30]。WPN 中1 638 cm-1和1 630 cm-1是主要的吸收带表示β-折叠的特征结构单元[31]。WPN 与菊粉复合后，菊粉3 411 cm-1处的特征峰消失，-OH 伸缩振动峰逐渐向低波数方向发生位移，说明菊粉与WPN 分子间的氢键作用增强。WPN 与透明质酸复合后与单一的透明质酸具有类似的情况。WPN 与阴离子多糖氢键作用是稳定分散体系的重要因素。红外谱图显示除了游离羟基和缔合羟基吸收峰位移有变化外，其余吸收峰没有明显的位移变化趋势，说明菊粉和透明质酸与WPN 之间没有新的基团生成，仅发生了氢键作用。

图3 多糖，WPN，BC（a）及复合物（b）的傅里叶变换红外图谱Fig.3 FTIR spectra of polysaccharide，WPN，BC （a） and complexes （b）

2.4 包封率

表2为3 种复合物的包封率。由表2可以看出WPN 复合HA 包埋BC 的包埋率最高为99.02%，与另外两种复合物的包埋率具有显著差异（P＜0.05），说明WPN 复合HA 对BC 具有更好的包埋和保护作用。这可能是由于透明质酸黏度大，分子链具有一定刚性使其呈现螺旋结构，进而在溶液中形成一定的网状结构使得WPN 纤维网状结构更加紧密。

表2 复合物的包封率Table 2 Encapsulation efficiency of complexes

2.5 DPPH 自由基清除活性

通过测量DPPH 自由基清除活性来评估每个样品的抗氧化活性。WPN 的抗氧化活性主要归因于其表面的巯基和其它氨基酸残基（Tyr，Trp，Met和Lys）[32]。β-胡萝卜素主要通过氢原子转移机制和单电子转移机制来清除自由基，共轭双键的特殊结构是它具有自由基清除能力的重要原因，其通过疏水作用与纤维蛋白络合，提高了自由基清除能力[33]。与单独的β-胡萝卜素相比添加或不添加多糖的纤维蛋白和β-胡萝卜素复合物具有更高的DPPH 自由基清除活性（P＜0.05）。多糖的添加进一步提高了复合物的DPPH 清除活性 （P＜0.05），其中添加HA 复合物的DPPH 清除活性比添加Inu 更强（P＜0.05）。

2.6 BC 降解动力学

图4为3 种复合物不避光室温下储存15 d的降解保留率。从图中可以看出15 d 后WPN/BC降解量最大，与复合多糖具有显著差异（P＜0.05）。WPN/BC 在储存期间BC 损失了 （93.08±0.13）%，复合多糖的BC 复合物仅损失50%左右，其中添加菊粉体系中BC 损失了（50.31±1.29）%，添加透明质酸体系中BC 损失了（53.75±0.17）%。由此可见多糖的添加所形成的体系对BC 有很好的保护作用，可有效延缓BC 的降解，延长BC 货架期。根据一级动力模型可以计算出3 种复合物中BC 的半衰期，WPN/HA/BC 和WPN/Inu/BC 半衰期分别为16 d 和15 d，WPN/BC 半衰期最短为4 d，再次证明了多糖的添加对复合物中的BC 有更好的保护作用，多糖复合颗粒的界面层更厚、更致密，整体颗粒密度更高，空间排斥更高。

图4 WPN/BC、WPN/Inu/BC 和WPN/HA/BC 保留率Fig.4 The retention rate of freeze-dried powder for WPN/BC，WPN/Inu/BC and WPN/HA/BC

表3 原材料和复合物的DPPH 清除活性Table 3 DPPH scavenging activity of raw materials and compounds

2.7 模拟体外胃肠释放

如图5所示，在SGF 中消化2 h 后，BC 从WPN/Inu/BC 和WPN/HA/BC 中分别释放约19%和21%，这为BC 在结肠中释放提供机会。2 h 后在SIF 中释放量平缓增加，该结果表明多糖复合的BC 在SIF 或SGF 中是连续而不是突然性释放的。这一方面可能因为WPN、多糖和BC 之间的疏水作用性和静电相互作用而紧密结合，另一方面菊粉不会被人体代谢消化，只能被肠道菌群代谢利用，因此包封在菊粉中的BC 可以在结肠中特异性地释放[40]，此外由于HA 在水溶液中结构膨胀，易包裹小分子BC，阻止BC 释放。因此纤维蛋白复合多糖的运载体系有机会实现BC 在结肠中靶向释放。

图5 体外模拟消化下BC 从复合物中的累积释放曲线Fig.5 Cumulative release profiles of BC from the complex during simulated in vitro digestion conditions

3 结论

本试验采用反溶剂法，制备两种乳清分离蛋白纤维复合多糖负载β-胡萝卜素的复合纳米颗粒。WPN/Inu/BC 和WPN/HA/BC 电位为（+48.27±0.65）mV 和（+44.83±0.8）mV，包封率为（94.34±1.35）%和（99.02±0.17）%，DPPH 自由基清除活性为（61.20±2.08）%和（68.85±1.84）%。储存稳定性试验表明15 d 后多糖复合的体系中BC 降解量约50%，WPN/Inu/BC 和WPN/HA/BC 复合粒子中BC 半衰期为15 d 和16 d。荧光光谱结果显示WPN 与多糖复合后暴露出更多的疏水基团从而与BC 更好的复合。红外光谱结果显示多糖和BC一些吸收峰发生偏移，说明它们与乳清分离蛋白纤维发生较强的氢键作用和疏水相互作用。体外模拟消化试验表明两种复合多糖的粒子都具有较好的控释能力。最终结果表明WPN/Inu/BC 和WPN/HA/BC 都表现出优于WPN/BC 的抗氧化性（DPPH 自由基清除活性）、包封率和储藏稳定性，并且在抗氧化性、包封率和储藏稳定性这3 个方面复合HA 的体系比复合Inu 的体系更优越。因此，WPN-多糖复合纳米颗粒可以作为一种有效的包埋体系来改善酸性饮料中β-胡萝卜素的物理和化学稳定性。