谢明杰， 赵龙昊

(辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁 大连 116081)

随着经济发展和人们生活水平的提高，2型糖尿病(T2DM)的发病率呈逐年上升的趋势，已成为威胁全球人类健康的慢性非传染性疾病[1].已有的研究表明，T2DM的发病机制十分复杂，与基因调控、肠道菌群和代谢水平等多因素影响有关[2].葛根为我国传统的中药材，将其用于治疗糖尿病在我国有着悠久的历史[3].本文以葛根的主要功效成分葛根素为实验材料，采用多组学策略，通过测定并分析葛根素对T2DM小鼠肠道菌群、代谢物和肠道基因表达水平的影响，探讨其调节T2DM小鼠糖代谢的作用机制.旨在为将葛根素开发为治疗糖尿病的临床药物或保健药物提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

6周龄SPF级雄性昆明小鼠，体质量(20±2) g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司.

1.1.2 实验药品

葛根素：纯度>98%，购自成都曼斯特生物科技有限公司；链脲佐菌素(streptozocin, STZ)购自上海生工生物工程有限公司；小鼠胰岛素(insulin, INS)酶联免疫检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所.

1.1.3 实验仪器

Illumina MiSeq DNA测序仪，美国Illumina公司；酶标仪，美国Thermo公司；PCR扩增仪，美国ABI公司；血糖仪，江苏鱼跃医疗设备股份有限公司.

1.2 方法

1.2.1 T2DM小鼠模型的建立及分组

将小鼠随机分为正常组(NM)和造模组，分别喂饲基础饲料和高糖高脂饲料.5周后禁食但不禁水12 h，造模组连续5 d腹腔注射1%(质量分数)STZ溶液40 mg/kg，NM组注射等体积柠檬酸缓冲液.最后一次注射72 h后，尾静脉采血所测得的血糖值>11.1 mol/L视为造模成功.将造模成功的小鼠再分为模型组(DM)和葛根组(Pue)，每组各6只.其中，Pue组小鼠按50 mg/kg/d灌胃葛根素药液0.2 mL，连续5周，NM组及DM组小鼠灌胃等体积蒸馏水.

1.2.2 小鼠血液相关指标的检测

待灌胃5周后取小鼠眼底静脉血，按照试剂盒说明收集血清，分别检测小鼠空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、空腹胰岛素(fasting insulin, FINS)水平，并按下列公式计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR)和胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index, ISI)：

HOMA-IR=(FINS×FBG)/22.5，

ISI=ln[1/(FINS×FBG)].

1.2.3 小鼠胰腺组织切片的制备与观察

将小鼠胰腺组织先放于Bouin液中固定，然后通过脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡、染色、封片等步骤制作石蜡切片，于光学显微镜下进行观察.

1.2.4 小鼠粪便和肠道组织的收集与保存

收集各组小鼠的新鲜粪便和小肠组织，将其在液氮速冻后于-80 ℃保存.采用Illumina MiSeq平台和LC-MS技术对样品进行肠道菌群测序、转录组测序和非靶向代谢物测定.样品的检测委托上海派森诺生物科技有限公司完成.

1.2.5 生物信息学分析

肠道菌群测序采用QIIME2软件、R脚本进行分析；转录组测序采用HTSeq、Sringtie等软件进行分析；代谢物测定采用Proteowizard、R脚本等软件进行分析.使用R软件计算各组学数据之间的等级相关系数.

1.2.6 统计学分析

采用SPSS21.0统计软件进行数据统计分析.组内比较采用单因素方差分析，组间采用t检验.P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著.

2 结果与分析

2.1 葛根素对小鼠血糖水平的影响

实验结果显示(表1)，葛根素能显著降低T2DM小鼠的血糖水平.其中，与DM组相比，Pue组小鼠的FBG和FINS分别下降了41.35%和29.66% (P<0.01).

表1 葛根素对小鼠血糖水平的影响

2.2 葛根素对小鼠胰腺组织的影响

小鼠胰腺组织切片结果显示(图1)，NM组小鼠的胰岛结构完整且规则，而DM组小鼠的胰岛结构被破坏，形状不规则，与周围组织混合难以识别.但用葛根素灌胃5周后，T2DM小鼠损伤的胰腺组织得到了很好的修复.

图1 小鼠胰腺组织切片(×400)Fig.1 Sections of mice pancreas tissues (×400)

2.3 葛根素对小鼠肠道菌群的影响

Illumina检测结果显示，葛根素能显著改变小鼠肠道菌群的物种组成.与DM组相比，Pue组小鼠肠道菌群的物种组成在门、目、属水平上均发生了显著的变化.但当利用葛根素灌胃T2DM小鼠5周后，可使DM组小鼠肠道菌群的物种组成基本恢复至正常水平(图2a).图2b为选取丰度变化位列前50的菌属所做的热图.红色表示丰度高，蓝色表示丰度低，颜色的深浅表示变化的强弱.由图可知，与NM组相比，DM组小鼠中的脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、螺杆菌属(Helicobacter)、Dorea、Mucispirillum、Prevotella、厌氧棍状菌属(Anaerotruncus)、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)等的丰度明显升高.当用葛根素灌胃T2DM小鼠5周后，Pue组小鼠肠道菌群的物种组成基本恢复至正常水平.其中，脱硫弧菌属、螺杆菌属、Dorea的丰度明显降低，而乳球菌属(Lactococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、Alistipes、丁酸弧菌属(Butyricimonas)等益生菌的丰度明显升高.

2.4 葛根素对小鼠代谢物的影响

按照P≤0.05且VIP≥1的标准进行筛选，与DM组相比，Pue组共筛选出505 个差异显著代谢物，包括193个上调代谢物，312个下调代谢物.按照分子量与数据库中的代谢物进行匹配，共鉴定出5-羟基-L-色氨酸等19种差异显著代谢物.其中，与DM组相比，Pue组中的5-羟基-L-色氨酸和褪黑素等代谢物的含量显著升高，苯乙酰谷氨酰胺等代谢物的含量显著降低.

2.5 葛根素对小鼠肠道基因表达水平的影响

按照表达差异倍数|lb FoldChange|>1和P<0.05的条件进行筛选，与DM组相比，Pue组共筛选出308个差异显著基因,包括204个上调基因，104个下调基因.其中，与DM组相比，Pue组中的Slc2a2、Haao、Foxa2、Slco4c1、Mbl2等基因的表达水平显著增加，Srebf1等表达水平显著降低.

3 讨 论

已有的研究结果表明，肠道菌群结构功能的紊乱与T2DM等多种疾病密切相关[4].如糖尿病患者常伴有肠道菌群比例的失衡，表现为拟杆菌门和厚壁菌门的丰度比值明显降低，梭菌与厚壁菌的比值明显升高等[5-6].本研究结果显示，葛根素可通过改变拟杆菌门与厚壁菌门的比例，降低脱硫弧菌属、螺杆菌属等有害菌群的丰度，提高双歧杆菌属、乳球菌属、乳杆菌属等益生菌群的丰度，使T2DM小鼠肠道菌群的物种组成基本恢复至正常水平.

代谢物的变化可从一定程度上反映内外源物质在生物体内的作用机制[7-9].5-羟基-L-色氨酸为血清素的前体物质，血清素能促进棕色脂肪组织摄取葡萄糖并将其转化为热能.有研究报道，5-羟基-L-色氨酸和褪黑素具有促进胰岛素分泌、糖原合成和糖酵解等作用，能显著改善高脂小鼠的葡萄糖耐受性，增强胰岛素敏感性，对T2DM的发生和发展具有很好的调节作用[10-11].苯乙酰谷氨酰胺是肠道菌群分解苯丙氨酸时产生的副产物，有研究结果显示，在患有T2DM的受试者血浆中检测出较高浓度的苯乙酰谷氨酰胺，其过高的含量可作为发生心肌梗死等风险的独立预测因子[12].本研究结果表明，葛根素可通过影响5-羟基-L-色氨酸、褪黑素和苯乙酰谷氨酰胺等代谢物的含量改善小鼠的T2DM.

给药前后小鼠基因组mRNA表达水平的变化，可为探讨葛根素治疗T2DM的机制以及寻找药物作用的靶点提供有力的支持[13].Slc2a2是青少年成熟型糖尿病代谢通路中的调控基因，主要参与编码葡萄糖转运体蛋白2.该蛋白缺失会使葡萄糖摄取受损、胰岛素分泌不足，最终导致高血糖的发生[14].Haao是调控NAD合成的关键基因，而NAD是三羧酸循环的重要辅酶，在促进机体的糖脂代谢中发挥重要作用[15].有研究报道:在胰岛素抵抗和肥胖小鼠中，增加由Foxa2编码的Foxa2活性，可使其对胰岛素的敏感性增强，降低血浆胰岛素和甘油三酯的含量[16-17]；由Slco4c1编码的Slco4c1蛋白可减轻糖尿病大鼠肾小球足细胞线粒体功能障碍，对糖尿病肾病的改善起着关键作用[18]；由Mbl2编码的甘露糖结合蛋白(mannose-binding lectin, MBL)可控制高脂血症患者的血糖和血脂水平，有利于缓解机体的炎症反应[19-20].Srebf1为胰岛素抵抗通路中的调控基因，其转录活性的降低可抑制小鼠脂肪细胞的脂质异常堆积，增强小鼠对胰岛素的敏感性[21].本研究结果表明，葛根素可通过影响Slc2a2、Haao和Cyp1a1等基因表达量改善小鼠的T2DM.

为了弄清基因-代谢物-肠道菌群对改善的T2DM的作用，对葛根素作用T2DM模型小鼠后的差异显著的基因、代谢物和肠道菌群进行了整合分析.结果显示，代谢物5-羟基-L-色氨酸和褪黑素含量的增加与unclassified_Rikenellaceae的丰度和Haao的表达量变化呈显著正相关.Slc2a2、Haao和Cyp1a1的表达量与Parabacteroides的丰度变化呈显著正相关，与Anaerotruncus的丰度变化呈显著负相关.上述结果表明，基因、肠道菌群和代谢物之间密切关联，葛根素可通过影响Slc2a2、Haao和Cyp1a1等基因表达量，改变unclassified_Rikenellaceae、Anaerotruncus和Parabacteroides等肠道菌群的丰度，调节5-羟基-L-色氨酸和褪黑素等代谢物的含量来改善小鼠T2DM.