唐济舟，黄炳泉，周云峰，邓杰华

1.赣州市食品药品检验检测中心，江西 赣州 341000；2.宜春市食品药品检验所，江西 宜春 336000

龙胆泻肝片是由龙胆、黄芩、木通、当归（酒炒）、柴胡、车前子（盐炒）、栀子（炒）、泽泻、甘草（蜜炙）和地黄10 种药味组成的复方制剂，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》第十二册，具有清肝胆、利湿热等功效［1］。龙胆泻肝片的现行质量标准含有性状、鉴别和检查项，而无含量测定项，这可能不利于药品整体质量的控制，有必要探索补充含量测定方法。目前，科研工作者主要对龙胆泻肝片中龙胆、黄芩、木通、地黄和栀子的含量进行了研究［2-4］，而对泽泻的定量控制几无报道。方中泽泻为佐药，具利小便、清湿热之能［5］，也有利胆保肝之效［6-7］。泽泻醇类是泽泻的主要有效成分，以23-乙酰泽泻醇B 最具代表性［8］。泽泻的野生资源日益枯竭，市场上流通的泽泻主要为人工栽培品，但由于种植地不一，地域和气候有差异，加之有较为廉价的窄叶泽泻掺伪混淆，导致泽泻质量参差不齐［9］。泽泻作为龙胆泻肝片的原料药之一，其定量指标的缺失，可能无法保证制剂的质量。因此，本研究以23-乙酰泽泻醇B 为定量成分，采用UPLC-MS/MS 法进行测定，以制定龙胆泻肝片中泽泻含量测定的方法。

1 仪器与试剂

超高效液相色谱-质谱联用仪（UPLC-MS/MS，型号：H-class/xevo TQD，美国Waters 公司）；超声波清洗仪（型号：KH-250DB，昆山禾创超声仪器有限公司）。

23-乙酰泽泻醇B 对照品（批号：111846-201705，纯度：99.7%，中国食品药品检定研究院）；龙胆泻肝片（市售8 批，来源于7 个厂家，信息见表1）；乙腈（质谱级，德国默克股份两合公司）；甲酸（质谱级，美国赛默飞世尔科技有限公司）；甲醇（色谱纯，德国西格玛奥德里奇贸易有限公司）；水为屈臣氏蒸馏水。

表1 8 批样品信息表

2 方法与结果

2.1 仪器测定条件

液相流动相：A-乙腈，B-0.1%甲酸溶液，流速：0.3 mL/min。梯度洗脱程序：0 min～1 min，70%B～70%B；1 min～3 min，70%B～20%B；3 min～7.5 min，20%B；7.5 min～8 min，20%B～70%B。色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱 温：30 ℃；进样量：5 μL。质谱参数：脱溶剂气流量1 000 L/h，锥孔气流量50 L/h，脱溶剂气温度600 ℃，多反应监测（MRM）模式，正离子扫描模式，检测离子对m/z 497 →437（定量）和m/z 497 →419。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取23-乙酰泽泻醇B 对照品10.65 mg，加甲醇制成含每1 mL 含23-乙酰泽泻醇B 1 061.805 ng 的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 样品经混匀（批号：19120005），取适量，研细，取2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 取不含泽泻的龙胆泻肝片，混匀，取适量，研细，取2 g，按“2.2.2”项下供试品溶液的处理方法制备阴性样品溶液。

2.3 标准曲线的制备

精密吸取对照品溶液适量，加甲醇制成含23-乙酰泽泻醇B 2.132 6 ng/mL、5.309 0 ng/mL、10.618 0 ng/mL、21.632 1 ng/mL、53.090 2 ng/mL、106.180 5 ng/mL 和212.361 0 ng/mL 一系列浓度的对照品溶液，吸取上述对照品溶液各5 μL 依次测定，以峰面积为纵坐标（Y），对照品浓度为横坐标（X），绘制标准曲线。回归方程为Y=48.608X-62.821，r=0.997 7，浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 专属性

分别吸取阴性样品溶液、供试品溶液（批号：19120005）和对照品溶液各5 μL，依次注入仪器测定，采集MRM 图（图1）。结果显示，供试品色谱图中出现与对照品色谱峰保留时间相对应的色谱峰，而阴性样品色谱图中未出现与对照品色谱峰保留时间相对应的色谱峰，阴性样品对测定无干扰，专属性良好。

图1 多反应监测图：A.阴性样品；B.样品；C.23-乙酰泽泻醇B

2.5 精密度

精密吸取对照品溶液，重复进样6 次，记录峰面积，23-乙酰泽泻醇B 峰面积的RSD 为1.87%，仪器精密性良好。

2.6 稳定性

取同一样品溶液（批号：19120005），在放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h 后，依次测定峰面积。测得含量的RSD 为2.68%，供试品溶液在24 h 内较稳定。

2.7 重复性

取6 份样品（批号：19120005），每份约2 g，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液，依法测定。含量的RSD 为2.9%，符合重复性要求。

2.8 加样回收率

样品（批号：19120005，含量为2.189 2 μg/g）经混匀，取适量，研细，平行称取6 份，每份1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，再精密加入23-乙酰泽泻醇B 对照品溶液（424.722 ng/mL）5 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，依次测定。回收率结果见表2，回收率符合分析方法验证指导原则［10］要求，该方法回收率良好。

表2 加标回收率

2.9 样品结果

取8 批供试品溶液，按“2.1”项下条件测定，计算含量，结果见表3，8 批供试品23-乙酰泽泻醇B 含量范围为0.105 3 μg/g～2.189 2 μg/g。

表3 样品含量结果（n=2）

3 讨论

查阅文献，有科研工作者已采用高效液相色谱法测定了龙胆泻肝丸中23-乙酰泽泻醇B 的含量［11-12］，为此，本研究前期采用HPLC 法测定龙胆泻肝片中泽泻的含量，发现大多数样品中未检测到与23-乙酰泽泻醇B 对照品色谱峰保留时间相对应的色谱峰，含量有可能为零。为验证结果的准确性，改用了灵敏度更高、分析速度更快的UPLC-MS/MS法进行分析，结果表明样品均含有23-乙酰泽泻醇B 成分。结果的差异性是因为龙胆泻肝丸中原料均以原粉入药，有效成分损失较少，转移率较高，而龙胆泻肝片中泽泻需要经过水提和再醇沉过程，且23-乙酰泽泻醇B 属于萜类成分，水溶性差。有文献报道［13］泽泻制成汤剂后23-乙酰泽泻醇B 的最低转移率只有2.4%，导致龙胆泻肝片中23-乙酰泽泻醇B 的含量偏低。

在质谱条件考察方面，采用较为稳定的MRM模式，同时比较了正离子模式和负离子模式下的响应情况，发现正离子模式响应较高。随后，对检测离子对进行优化，初步采用母离子为m/z 515［M+H］+、子 离 子 为m/z 497［M+H-H2O］+和 子 离 子m/z 437［M+H-H2O-CH3COOH］+的 离子对进行检测，发现检测响应并不理想，而改用m/z 497［M+H-H2O］+为母离子，m/z 437［M+HH2O-CH3COOH］+和m/z419［M+H-H2O-CH3COOHH2O］+为子离子进行分析时，其检测响应大了一个数量级，同时考虑到邰艳妮等［14］测定泽泻药材中23-乙酰泽泻醇B 的含量采用的最佳灵敏度母离子为m/z 497［M+H-H2O］+，最终选择m/z 497 →437（定量）和m/z 497 →419 作为测定离子对。

23-乙酰泽泻醇B 可溶于甲醇，在样品处理方法考察时，采用甲醇作为提取溶剂，同时研究超声10 min、30 min、40 min 和加热回流0.5 h、1 h、2 h 两种提取方式对23-乙酰泽泻醇B 含量测定的影响，发现在超声30 min 或加热回流1 h 后，样品中23-乙酰泽泻醇B 已提取完全，考虑方法的便捷性，采用甲醇超声30 min 作为样品处理方法。

从含量结果可以看出，不同厂家的龙胆泻肝片中23-乙酰泽泻醇B 的含量具有一定差异性，最高相差十几倍，质量参差不齐。目前龙胆泻肝片所执行的质量标准没有对泽泻的质量进行控制，无定性定量指标，可能会存在少投料、掺伪品或提取后药渣继续使用的风险，有必要规范泽泻的来源性并对处方中泽泻的23-乙酰泽泻醇B 含量设定下限值，此项工作有待进一步研究。

综上所述，本研究所建立的UPLC-MS/MS 法能有效测定处方中23-乙酰泽泻醇B 的含量，可用于泽泻定量指标的考察，对于提升泽泻质量和保证药品有效性具有积极意义。