固相萃取-超高效液相色谱法测定鱼腥草中的汞

2022-01-09谢慧英谭洪涛周鸿

药品评价 2021年22期

谢慧英，谭洪涛，周鸿

江西省疾病预防控制中心，江西省食源性疾病诊断溯源重点实验室，江西南昌 330029

鱼腥草为三白草科植物蕺菜（Houttuynia cordataThumb.）的新鲜全草或干燥地上部分，能清热解毒、消肿疗疮、利尿除湿、湿热止痢等，具有抗菌、抗病毒、提高机体免疫力、利尿等作用，是常见的药食同源植物［1］。鱼腥草在种植和生产加工过程中可能受到重金属的外源性污染［2-3］，重金属通过食物链在体内代谢缓慢，易蓄积，当人体内重金属含量过量时会导致各种疾病的发生。如汞中毒对人体的神经系统、心血管系统和免疫系统产生危害，甚至致癌作用［4］。为保障人体健康，开展药食同源中重金属的分析研究具有重要意义。

重金属的主要分析方法有原子荧光法［5］、光度法［6］和电感耦合等离子体质谱法［7］。与这些方法相比，高效液相色谱法因具有分离能力强、成本低、检出限低等优点，已成功应用于重金属分析的研究［8-10］。由于药食同源的重金属基质复杂且含量较低，因此测定前需对重金属进行提取和净化等富集前处理过程。固相萃取是常用的富集和净化方法，而固相萃取吸附剂是固相萃取富集和净化效果的关键步骤，常用的吸附材料有活性炭、C18、离子印迹聚合物、碳纳米管等［11-14］。其中，碳纳米管具有化学稳定性高、吸附能力强、吸附容量大和价格低廉等优点，少量的碳纳米管填料能高效富集农药、多环芳烃、金属离子等污染物，从而提高分析方法的灵敏度［15-18］。本文采用水浴消解提取鱼腥草中的汞，使之与有机试剂络合，以多壁碳纳米管为填料，制备固相萃取小柱净化金属络合物，结合超高效液相色谱建立了鱼腥草中汞的测定方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC H-Class 超高压液相色谱仪（美国Waters 公司）；Milli-Q 超纯水系统（美国Millipore 公司）；电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）；MS304S 电子天平（梅特勒-托利多公司）。

汞标准溶液（1 000 μg/mL，国家标准物质研究中心）；多壁碳纳米管（MWCNTs，纯度≥95%，直径8～15 nm，长度50 μm）购自南京吉仓纳米科技有限公司；聚丙烯固相萃取空柱（6 mL，天津博纳艾吉尔科技有限公司）；浓硝酸、浓盐酸（优级纯，上海国药集团有限公司）；二乙基二硫代氨基甲酸钠（DDTC，分析纯，上海阿拉丁生化科技有限公司）；甲醇、乙腈、丙酮、乙醇（色谱级，美国Merck 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的配制移取适量的汞标准溶液，用5%硝酸稀释，配制成3.0 μg/mL 标准储备液，在4 ℃保存。

1.2.2 样品前处理称取2.0 g 鱼腥草样品于50 mL试管中，加入20 mL 王水（浓硝酸：浓盐酸=1∶3），置于沸水浴中消解20 min 后，取出消解液，用水定容至100 mL，调节溶液pH 至9.0。在标样和样品消解液中分别加入0.05 mol/L DDTC 溶液200 µL，反应5 min，待净化。

准确称取20 mg 多壁碳纳米管，装入6 mL 的聚丙烯固相萃取空柱中，均匀填充后，放置固相萃取柱专用筛板。固相萃取小柱使用前依次用15 mL甲醇和10 mL 纯水活化，将待净化样液以1 mL/min的速度上样，弃流出液，用10 mL 水淋洗，弃淋洗液，最后用8 mL 乙腈洗脱，收集洗脱液，氮吹至近干，用1 mL 甲醇溶解，过0.22 µm 滤膜，待测。

1.2.3 色谱条件色谱条件：色谱柱，Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温，35 ℃；进样量，10 μL；流速，0.3 mL/min；波长，280 nm；流动相，乙腈-水（80∶20）。

2 结果与分析

2.1 样品溶液pH 的优化

样品的pH 值是影响多壁碳纳米管对汞吸附效率的重要因素之一，因而分别用磷酸盐缓冲溶液调节溶液pH 值至5～10，再进行固相萃取实验，如图1所示多壁碳纳米管对汞的吸附能力随着pH 值的增大而增大，当pH 值的增大到9 时，多壁碳纳米管对汞的吸附量达到最大值，DDTC 在碱性条件下不稳定性优于酸性条件［19］，本实验选择溶液的pH 值为9。

图1 pH 对萃取回收率的影响

2.2 DDTC 使用量的优化

DDTC 能与许多金属发生络合反应，形成稳定的络合物，是应用较为广泛的金属螯合剂［20］。考察DDTC 的使用量对络合反应的影响：从图2 可看出，当DDTC 的使用量由120 µL 增加至200 µL时，目标物的峰响应逐渐呈上升趋势；使用量为200 µL～250 µL 时，目标物峰面积的响应逐渐下降，因而实验最终加入200 µL 的DDTC 溶液与汞形成Hg-DDTC 络合物。

图2 DDTC 使用量的影响

2.3 洗脱溶剂的优化

鱼腥草消解后有一定的干扰物质，为实现最佳净化效果，考察了甲醇、乙腈、丙酮、乙醇等不同洗脱溶剂对汞回收率的影响，结果表明，乙腈的洗脱效果更好（见图3）；为保证固相萃取柱中富集的待测目标物完全洗脱，对比不同体积的乙腈洗脱同一样品，从4 mL～10 mL 递增洗脱液测定回收率。结果表明，当乙腈的体积小于8 mL 时，回收率随洗脱液体积的增加而提高，当洗脱液的体积大于8 mL 后，随洗脱液体积的增加回收率趋向稳定，因此选择8 mL的乙腈洗脱。

图3 不同洗脱液的影响

2.4 专属性实验

在本实验的条件下，K+、Na+、Ca2+、Mg2+、SO42-、CO32-等离子不能与DDTC 形成络合物，因而不会干扰实验；基质中加入较低浓度的Ni2+、Cd2+、Cu2+，这三种金属离子能与DDTC 发生络合反应，但可以在最佳优化条件下，通过液相色谱条件达到分离，以减少本实验的干扰，空白溶液在出峰位置无干扰，专属性良好。见图4。

图4 空白溶液(a)、样品溶液(b)和加标溶液(c)的色谱图

2.5 工作曲线与检出限

分别移取0.10 mL、0.50 mL、1.5 mL、3.0 mL、5.0 mL、10.0 mL 汞标准储备液（3.0 µg/mL）于100 mL容量瓶中，调节溶液pH 至9.0，加入DDTC 溶液络合，通过多壁碳纳米管固相萃取柱净化。在最佳测定条件下，Hg-DDTC 络合物在3.0～300 µg/L 浓度范围内呈良好的线性关系，线性方程为Y=11 467X+8 297，相关系数（r）大于0.999；Hg-DDTC 络合物的检出限和定量限分别以3 倍和10 倍信噪比（S/N）计算，Hg-DDTC 络合物的检出限为0.15 µg/L，定量限为0.5 µg/L。

2.6 加标回收实验

精密称取已测得含量（0.004 6 mg/kg）的同一份鱼腥草样品6 份，每份2 g，分别加入0.20 mL汞标准溶液（0.06 µg/mL），按“1.2.2”项下方法制备供试液，在上述“1.2.3”条件下进行分析测定，计算汞的回收率，测得汞的加标回收率为73.6%～84.8%，RSD 为5.7%，结果见表1。