何海艳，刘梦婷，杨爱萍，蒋彩云，崔 逸，汪洪涛

（1.江苏经贸职业技术学院健康学院，江苏 南京 211168；2.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏 南京 210023）

高血压是最常见的慢性心血管疾病，与人类多种脏器并发症紧密联系，严重危害人类的健康。据统计，全球成人高血压患病率约为30%，中国高血压病患高达2.45亿 人[1]，有鉴于此，《国务院关于实施健康中国行动的意见》（国发〔2019〕13号）已经对包括高血压在内的重大慢性病发起了“攻坚战”。肾素血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统是机体调节血压的重要系统，其中血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）I会促进肾素血管紧张素系统的升血压和减弱激肽释放酶-激肽系统的降血压作用，因此，抑制ACE活性是控制血压的一种有效措施[2]。

目前，临床降血压药物ACE抑制剂如卡托普利、阿拉普利、依那普利和赖诺普利等虽然药效明显，但会引起呕吐、心悸等副作用[3]。近年来，食物源生物活性肽因其营养、安全性引起了极大的关注，研究人员已经从鸡蛋、鱼肉等动物蛋白源以及青豆、海藻、花生等植物蛋白资源中获得多种食源性ACE抑制肽[4]，并且阐明了相关活性机制和降血压活性效果[5]。最新的研究认为，血压轻度升高会使患者产生记忆力下降和患阿尔茨海默病的风险[6]，不仅高血压患者需要降血压，正常人收缩压降低5 mm Hg也会大大降低心血管事件风险[7]；因此，活性肽等类似的降血压产品将具有广阔的应用空间。

南瓜籽中含有30%～40%的蛋白质，氨基酸组成丰富，是一种较好的植物蛋白资源。目前，关于南瓜籽蛋白源ACE抑制肽的研究相对较少，南瓜籽肽可能存在的ACE抑制分子机制也不够清楚。因此，本实验采用碱性蛋白酶水解南瓜籽蛋白释放ACE抑制肽，通过膜分离技术获得ACE抑制肽并通过质谱技术鉴定其结构，同时利用ACE抑制活性实验、自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHRs）模型、抑制动力学和分子对接方法研究ACE抑制肽的降血压活性和酶抑制机制，以期为南瓜籽降血压肽的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SHRs（SPF级无特定病原体（生产许可证号SCXK（苏）2019-0001） 北京维通利华实验动物技术有限公司。

南瓜籽为乌鲁木齐市售；碱性蛋白酶（Alcalase）、ACE、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（N-[3-(2-furylacryloyl)]-L-phenyalanyl-glycyl-glycine，FAPGG） 北京索莱宝科技有限公司；兔肺ACE（酶活力100 U/L） 美国Sigma公司；透析袋 美国Thermo Fisher公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

RET磁力搅拌器 德国IKA公司；FE20K pH酸度计美国贝克曼库尔特公司；Allegra64R高速冷冻离心机瑞士梅特勒-托利多公司；荧光酶标仪 美国Spectra MAX Gemini公司；Stirred Cell 8010超滤装置 美国Millipore公司；真空冷冻干燥机 德国Christ公司；高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱仪（high performance liquid chromatography quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry，HPLC/Q-TOF-MS/MS）（配有光电二极管矩阵检测器和TOF检测器） 美国SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 南瓜籽蛋白的水解及水解物的膜分离

参考Chen Wenye等的方法，采用碱溶酸沉法提取南瓜籽分离蛋白（pumpkin seed protein isolate，PPI）[8]。将PPI溶于蒸馏水至终质量浓度5 g/100 mL，以1 mol/L NaOH溶液调pH值至8.0，水浴搅拌加热至50 ℃并保温，添加碱性蛋白酶（添加量为4%，以PPI质量计）消化4 h，酶解过程以1 mol/L NaOH溶液维持pH值不变，每10 min记录消耗NaOH的体积，用以计算水解度；水解反应结束后，以2 mol/L HCl溶液调节pH值至4.5，并将反应容器沸水浴加热10 min，冷却至室温，8 000×g离心20 min，上清液即为南瓜籽蛋白水解物（pumpkin seed protein hydrolysate，PPH），部分PPH以截留分子质量100 Da透析膜透析后冻干，部分PPH依次通过截留分子质量1、3、5、10 kDa的超滤膜，透过液透析后冻干，于－20 ℃下贮存备用。

1.3.2 水解度的测定

采用pH-stat法[9]测定南瓜籽蛋白水解过程中的水解度，并根据公式（1）计算。

式中：c为NaOH溶液的浓度/（mol/L）；V为NaOH溶液的体积/mL；m为蛋白质的质量/g；α为水解时α-NH2的平均离解度（对南瓜籽蛋白，1/α取值为1）；htot为水解度常数（对南瓜籽蛋白，htot取值为8 mmol/g）。

1.3.3 ACE抑制活性的测定

根据Yang Yijie等的方法测定样品的ACE抑制活性[10]。配制80 mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH 8.2，含有300 mmol/L的NaCl），用于溶解样品、FAPGG（1 mmol/L）、ACE（100 U/L），96 孔板依次加入40 μL样品、50 μL底物FAPGG、10 μL ACE，以磷酸盐缓冲液为空白对照，置于37 ℃恒温振荡5 min后，30 min内每隔2 min测定340 nm波长处的吸光度，根据公式（2）计算ACE抑制率。

式中：v样品为样品的ACE酶促反应速率/min－1；v空白对照为空白对照的ACE酶促反应速率/min－1。

1.3.4 体内降血压活性评价

参照罗鹏等的方法[11]，将体质量270～320 g雄性SHRs随机分组（每组5 只），分别灌胃1 mL生理盐水（空白对照组）、卡托普利（10 mg/kgmb）、PPH（大于100 Da的PPH样品，后同）及低于1 kDa PPH组分（100 mg/kgmb）、合成南瓜籽肽（30 mg/kgmb），卡托普利和实验样品均溶于生理盐水。采用夹尾法测量SHRs的收缩压和舒张压，结果以灌胃前后2、4、6、8、24 h SHRs血压差表示。

1.3.5 肽的结构鉴定

采用LC-MS/MS鉴定低于1 kDa PPH组分中多肽组成。LC条件：色谱柱C18（4.6 mm×250 mm）；流动相A为水，流动相B为乙腈（含有体积分数0.1%甲酸），进样体积10 μL，流速0.5 mL/min，流动相B 5%～95%梯度洗脱，洗脱时间20 min。MS条件：电喷雾离子源、碰撞能量35 V、锥孔电压40 V。利用PEAKS Studio软件分析活性肽序列并对比数据库（UniProt）予以确认。经MS鉴定的南瓜籽肽于南京杰肽生物科技有限公司合成，纯度达到98%。

1.3.6 酶的抑制动力学分析

参考He Rong等的方法分析南瓜籽肽的ACE抑制动力学[12]。抑制ACE的底物（FAPGG）浓度分别配制为0.0625、0.125、0.25、0.5、1 mmol/L。按照1.3.3节方法进行反应。根据酶促反应速率（1/v）与底物浓度（1/[S]）的倒数作Lineweaver-Burk双倒数图，确定南瓜籽肽的ACE抑制模式，根据图形y轴和x轴的截距分别计算抑制参数（最大酶促反应速率vmax和米氏常数Km）。

1.3.7 分子对接

参考管骁等的方法[13]以Protein Data Bank数据库1O8A晶体结构为本研究的ACE受体，采用Chemdraw软件绘制南瓜籽肽MLPL、RFPLL、LLPGF和LVF的分子结构，利用分子模拟软件Discovery Studio（DS）中的CHARMm程序将肽分子能量最小化，利用CDDOCK程序对接南瓜籽肽和ACE。分子对接去除1O8A的配体、保留Cl原子和Zn原子，对接活性位点x为41.311、y为33.976、z为46.128，半径10 Å。选择DS软件对接评分最高结果分析结合自由能、氢键、疏水基团和带电基团等指标。

1.4 数据处理与分析

采用GraphPad Prism软件绘制图形，采用SAS软件对数据进行单因素方差分析、Duncan多重比较，以P＜0.05表示差异显著，每个实验重复3 次以上。

2 结果与分析

2.1 南瓜籽蛋白的水解及水解物膜分离组分的活性分析

如图1A所示，南瓜籽蛋白的水解度与水解时间呈正相关，水解开始1 h内水解度增加较快，水解度达到7.99%；60～200 min内水解度增加了2.99%，水解反应速率明显变慢，4 h后水解度达到11.23%，南瓜籽蛋白在碱性蛋白酶的作用下充分释放了其中的活性肽。不同蛋白质的水解度与蛋白的种类及结构有关，例如，张齐等采用碱性蛋白酶制备文冠果蛋白酶解肽，水解度高达18.21%[14]，显著高于本实验中南瓜籽蛋白的水解度；而原洪等采用碱性蛋白酶制备花椒籽蛋白酶解肽，水解度则仅为7.23%[15]。

由图1B可知，1 mg/mL质量浓度下，PPH ACE抑制活性也因水解物分子质量的不同而有所差别。PPH和低于1 kDa肽组分的ACE抑制活性较高，二者ACE抑制活性没有显著性差异（P＞0.05），分别为46.81%和46.22%；除3～5 kDa组分外，ACE抑制活性随着PPH分子质量的增大而逐渐降低，5～10 kDa组分ACE抑制活性最低，抑制率为33.74%。综上可知，低分子质量的南瓜籽多肽具有较高的ACE抑制活性，Zou Zhipeng等研究麦麸蛋白水解物时也发现低于1 kDa麦麸蛋白水解物组分的ACE抑制活性显著高于麦麸蛋白水解物[16]。

PPH的降血压活性如图1C所示，SHRs灌胃PPH（100 mg/kgmb）后，PPH及低于1 kDa PPH组分在灌胃4 h时表现出了相似的降血压效果，均降低SHRs收缩压约14.80 mm Hg，而低于1 kDa PPH组分在灌胃6 h时表现出了最好的降血压效果，降低SHRs的收缩压约21.42 mm Hg，低于1 kDa PPH组分的降血压活性优于PPH；低于1 kDa PPH组分虽然表现出持续的降血压效果，但是仍差于降血压药物卡托普利。与其他相关研究相比，PPH表现出适中的降血压效果，Chay等研究发现蚕豆籽水解物在300 mg/kgmb的剂量下灌胃4 h后的降压效果最好，约降低SHRs血压19.3 mm Hg[17]；邹智鹏等研究发现小米蛋白水解物低于1 kDa组分（100 mg/kgmb）灌胃6 h后约降低SHRs的收缩压37.8 mm Hg[18]。

图1 南瓜籽蛋白的水解及水解物膜分离组分的活性Fig. 1 Hydrolysis of pumpkin seed protein and the activity of membrane ultrafiltration fractions from pumpkin seed protein hydrolysate

2.2 南瓜籽蛋白肽结构鉴定

由上述研究结果可知，低于1 kDa PPH组分具有较好的生物活性，为了确定可能引起活性的肽段结构，采用HPLC/Q-TOF-MS/MS鉴定了低于1 kDa PPH组分中南瓜籽蛋白肽组成。在获得低于1 kDa PPH组分的总离子流色谱图和一级质谱图（图2）的基础上，利用PEAKS Studio软件分析并比对UniProt数据库，从低于1 kDa PPH组分中鉴定出了9 种多肽，分别是Leu-Leu-Val（LLV）、Leu-Val-Phe（LVF）、Leu-Thr-Pro-Leu（LTPL）、Ser-Val-Leu-Phe（SVLF）、Leu-Leu-Pro-Gln（LLPQ）、Met-Leu-Pro-Leu（MLPL）、Leu-Leu-Pro-Gly-Phe（LLPGF）、Val-Leu-Leu-Pro-Glu（VLLPE）、Arg-Phe-Pro-Leu-Leu（RFPLL）。此外，通过尝试检索生物活性肽数据库发现所鉴定的9 种南瓜籽肽均未出现在这些ACE抑制肽或者降血压肽数据中，仅发现了类似的降血压肽序列，如LLY、LVY、LVE、LLP、LLF等（检索数据库：http://bis.zju.edu.cn/biopepdbr/index.php、http://pepbank.mgh.harvard.edu、http://www.nipgr.ac.in/PlantPepDB/），说明本研究从PPH发现了新的ACE抑制肽。

图2 南瓜籽蛋白低于1 kDa组分的总离子流色谱图（A）和一级质谱图（B）Fig. 2 Total ion current chromatogram (A) and primary mass (B)spectrum of fractions with molecular mass less than 1 kDa from pumpkin seed protein hydrolysate

2.3 南瓜籽肽的ACE抑制活性及降血压活性

如图3A所示，9 种多肽RFPLL、VLLPE、LLPGF、MLPL、LLPQ、SVLF、LTPL、LVF、LLV的ACE半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分别为0.94、16.57、0.48、0.36、5.32、7.11、5.07、0.17、3.16 mmol/L，其中LLPGF、MLPL、LVF和RFPLL的IC50均低于1 mmol/L，具有较高的ACE抑制活性。多肽的生物活性与其序列和氨基酸组成有着显著的相关性，N端和C端含有疏水性和芳香族氨基酸残基以及含有Arg、Pro的活性肽具有较好的ACE抑制活性[19-20]，南瓜籽蛋白肽N端和C端含有Phe、Leu和Val等疏水性氨基酸，因此具备了较好的ACE抑制活性。此外，肽链的长短对ACE抑制活性也有一定的影响，例如，Zhang Peng等从小麦面筋蛋白水解物中分离得到高活性ACE抑制肽SAGGYIW和APATPSFW，其IC50分别为0.002 mg/mL和0.036 mg/mL[21]；Bhaskar等从马豆粉中分离出ACE抑制肽TVGMTAKF和QLLLQQ，其IC50分别为30.3 μmol/L和75.0 μmol/L[22]，这些ACE抑制肽都具有较长的肽链以及特殊的氨基酸组成。

此外，进一步评价了ACE抑制活性较好的南瓜籽肽LLPGF、MLPL、LVF和RFPLL的降血压活性（图3B、C）。总体看来，RFPLL具有较好的降血压活性，灌胃SHRs 6 h后使其收缩压降低37.0 mm Hg、舒张压降低17.0 mm Hg；其次是LVF，灌胃SHRs 6 h后使其收缩压降低22.2 mm Hg、舒张压降低11.2 mm Hg；而LLPGF和MLPL的降血压活性相对较差；RFPLL和LVF灌胃SHRs 24 h后仍然具有一定的降血压活性，并且在测试的剂量下RFPLL与卡托普利降血压效果较为接近，说明从南瓜籽蛋白中获得了效果较好的降血压肽。另一方面，体外ACE抑制活性与降血压活性存在一定的差异，ACE抑制活性相对较差的RFPLL却表现出了较好的降血压活性，类似的情况也有相关报道，如He Rong等从菜籽蛋白中分离得到ACE抑制活性相当的TF、RALP，30 mg/kg剂量下RALP降低SHRs血压效果（16 mm Hg）明显优于TF[23]，Yang Yijie等进一步研究发现RALP在代谢过程中发生降解，产生了活性更高的肽段ALP、LP和RA[10]，本研究所获得ACE抑制肽RFPLL也可能发生了类似的代谢降解。

图3 南瓜籽肽的ACE抑制活性及降血压活性Fig. 3 ACE inhibitory and antihypertensive activity of pumpkin seed peptides

2.4 南瓜籽肽抑制ACE的动力学分析

采用Lineweaver-Burk双倒数图探讨南瓜籽肽RFPLL、LLPGF、MLPL和LVF抑制ACE的动力学模式。由图4可知，RFPLL是ACE混合型抑制剂，低浓度下（0.5 mmol/L）RFPLL对ACE是竞争性抑制，较高浓度（1 mmol/L）表现出了非竞争抑制作用；MLPL的双倒数直线近似相交于y轴，说明其对ACE的抑制模式可能是竞争性抑制，而LLPGF、LVF可能是非竞争性抑制类型。综上，RFPLL通过与FAPGG竞争性结合ACE或者形成RFPLL-ACE-FAPGG复合物而降低ACE活性；MLPL可能主要通过与ACE的活性位点直接结合来抑制ACE活性；LLPGF和LVF通过与ACE-FAPGG复合物结合，改变ACE的空间构像而降低ACE活性。Ma Feifei等从银杏蛋白中分离得到1个ACE非竞争性抑制肽TNLDWY和2个竞争性抑制肽RADFY、RVFDGAV[24]。

图4 南瓜籽肽抑制ACE动力学双倒数图Fig. 4 Lineweaver-Burk plots for ACE inhibitory kinetics of pumpkin seed peptides

2.5 南瓜籽肽与ACE的分子对接

体细胞ACE分子C端活性中心含有3个活性位点S1（Y523、E384）、S1’（E162、D377）和S2’（Y520、K511、H513、H353、A354）和1个三联体催化部位（His383、His387、Glu411与Zn2+配位结合）[25-26]。南瓜籽肽与ACE的分子对接结果如图5所示，RFPLL、LLPGF、MLPL和LVF均能够较好地对接于ACE的活性中心残基，其中，RFPLL与ACE的残基Tyr523、Glu162、Asp377之间形成3个氢键，并通过O31、O28螯合Zn2+，获得了较低的静电势能－231.64 kJ/mol，说明RFPLL能够通过结合ACE活性位点S1、S1’及三联体催化部位发挥抑制活性；小分子肽LVF与ACE的5个残基His353、Ala354、Tyr520、Lys511、Gln281之间形成9个氢键，并且O2与Zn2+的距离仅有2.78 Å，也说明了LVF能够通过结合ACE活性位点S2’及三联体催化部位发挥抑制活性；LLPGF和WLPL分别与ACE的氨基酸残基之间形成5个和7个氢键，但是结合势能相对较高，分别为－112.99 kJ/mol和－80.00 kJ/mol。分子对接模拟进一步说明4个南瓜籽肽具有ACE抑制活性。类似地，有研究表明乳清蛋白肽IIAE、LIVTQ、LVYPFP通过与ACE活性中心残基Gln259、His331、Thr358之间形成了较强的氢键从而表现出ACE抑制活性[27]；此外，3D药效团模拟分析结果表明活性肽与ACE活性中心残基Trp279、Gln281、His353、Ala354、Ser355、Ala356、His383、Glu384、Glu411、Asp415、Lys454、Phe457、Lys511、His513、Tyr520、Tyr523形成氢键，氢键可以很好地抑制ACE活性[28]。

图5 南瓜籽肽与ACE的分子对接Fig. 5 Molecular docking of pumpkin seed peptides to the ACE active sites

3 结 论

本实验采用碱性蛋白酶水解南瓜籽蛋白，经膜分离和质谱鉴定技术获得高活性南瓜籽肽氨基酸序列，同时分析了南瓜籽肽的降血压活性和ACE抑制机制，结果表明：1）低于1 kDa PPH组分具有较高降血压活性，灌胃6 h后可以降低SHRs的收缩压约21.42 mm Hg；2）南瓜籽肽RFPLL、LLPGF、MLPL和LVF具有较好的ACE抑制活性，IC50均低于1 mmol/L，其中RFPLL和LVF具有较好的降血压活性，灌胃6 h后分别使SHRs的收缩压降低37.0 mm Hg和22.2 mm Hg、使SHRs的舒张压降低约17.0 mm Hg和11.2 mm Hg；3）RFPLL、LLPGF、MLPL和LVF可以很好地对接ACE的活性中心，RFPLL是ACE混合型抑制剂，MLPL对ACE是抑制模式可能是竞争性抑制，LLPGF、LVF可能是ACE的非竞争性抑制剂。综上，低于1 kDa PPH是一种良好的降血压功能食品原料，而RFPLL和LVF可用于降血压功能食品或者药品的开发原料。