王秋玲 沈罟 丁芷萱 王俊珊 汪芳 诸葛萦

心肌缺血再灌注损伤(myocardium ischemiareperfusion injury，MI-RI)是指心肌组织经过急性缺血事件后，当迅速恢复血流灌注时，缺血组织不仅没有得到改善或恢复，反而引起心肌细胞凋亡、心肌结构功能损伤加剧的现象[1]。MI-RI通常引起心律失常及心功能持续恶化，其发生机制复杂，涉及氧自由基爆发、细胞凋亡、钙超载及代谢障碍等。目前治疗心肌梗死无法有效避免MIRI，这严重制约了冠心病的治疗效果。

脂质体可天然存在，也可人工合成[2]，类似于生物细胞膜，是由亲水头部和亲脂尾部构成的脂质双分子层，该结构可将药物包载其中。脂质体递药系统(liposome drug delivery system，LDDS)是指脂质体包载药物并使药物选择性地浓集于靶向部位的给药系统[3]，这种天然的炎症靶向效应使药物更多地聚焦病变部位，从而增强药物在局部组织的疗效，同时延长了药物血浆半衰期、减少药物有效剂量和药物不良反应。为此，本研究分别制备IR-775 荧光脂质体、胺碘酮脂质体和丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate，EP)脂质体等药物，并在缺血-再灌注(I-R)损伤模型中考察其靶向性及治疗优势。进而探讨治疗MI-RI的一种新策略。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，鼠龄8～9周，体重(260±20)g(购自上海市崇明区实验动物中心)、盐酸胺碘酮(上海泰坦化学有限公司)、丙酮酸乙酯(南京化学试剂股份有限公司)、IR-775荧光染料(上海泰坦化学有限公司)、GAPDH 鼠单克隆抗体(巴傲得生物科技有限公司)、Bax鼠单克隆抗体(杭州华安生物技术有限公司)、Bcl-2鼠单克隆抗体(巴傲得生物科技有限公司)、Caspase-3鼠单克隆抗体(上海朗顿生物科技有限公司)、ECL 发光试剂盒(GE 公司)、BCA 蛋白定量试剂盒(美国Sigma-Aldrich公司)。小动物呼吸机(型号ALC-V8，上海奥尔科特生物科技有限公司)、Western 显影仪。

1.2 实验方法

1.2.1 脂质体药物制备及考察 采用薄膜分散-超声-膜挤出法制备载药脂质体，使用Box-Behnken设计法，以磷脂与胆固醇质量比、磷脂与药物质量比以及超声时间为优化设计的三个因素，以包封率为响应值，优化脂质体的处方和制备工艺，得到最优载药脂质体处方，使用马尔文粒度仪考察脂质体粒径、zeta电位及粒度分布，并测量脂质体的包封率[4]。

在室温条件下称取一定量的胺碘酮或者EP药物以及适量的胆固醇和蛋黄卵磷脂置于100 ml的圆底烧瓶中，加入20 ml氯仿搅拌均匀，使药物完全溶解，将烧瓶置于旋转蒸发仪中，在60℃水浴条件下减压旋蒸，以彻底挥发有机溶剂，当看到瓶底形成半透明膜或者白色蜂巢状膜时，加入7 ml生理盐水，充分摇晃震荡直至薄膜水化，探针超声一定时间后，过0.45μm 聚碳酸酯膜3次，即可得到脂质体药物的混悬液。将制备好的胺碘酮脂质体及EP脂质体放于4℃冰箱保存备用。

1.2.2 实验动物建模与分组 雄性SD 大鼠术前禁食禁饮8 h。用1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。在喉镜直视下插管，气管与小动物呼吸机相连进行机械通气。具体参数：呼吸频率80次/分，潮气量为每100 g体重2 ml，呼吸比1∶2，吸入气中氧浓度99%。I-R 组制备：在第四肋间打开大鼠胸腔，暴露左胸腔，尾静脉注射300 u/kg普通肝素，10 min后在肺动脉圆锥与左心耳交界处下方约2 mm处用无创动脉夹夹闭冠状动脉左前降支(LAD)，建立缺血模型，缺血30 min后打开动脉夹恢复LAD血流。术后立即尾静脉注射0.2 ml相关药物或溶液。假手术组制备：大鼠开胸，暴露LAD 不予夹闭，其余操作同前。大鼠建立MI-RI模型时，在四肢皮下各置入一电极，连接心电图机，观察建模、用药前后心电图变化。

1.2.3 大鼠心肌I-R 模型IR-775荧光成像实验IR-775氯化物属七甲吲哚类近红外染料，属亲脂性阳离子化合物。其荧光最大激发及发射波长在795～815 nm 之间，作为IR 系列近红外染料的一种，广泛运用于活体动物或细胞的荧光成像。IR-775 脂质体制备操作如下：在50 m L 圆底烧瓶中，加入精密称得的处方量蛋黄卵磷脂、IR-775 和胆固醇，再加入适量氯仿，于超声辅助下充分溶解。在40℃、40 rpm 下，减压蒸发除去氯仿，得到透明均匀的脂质体膜。加入适量生理盐水剧烈振摇至薄膜完全脱落溶解，并及时封口。将烧瓶置于水浴中，充分水化，得到白色乳状脂质体混悬液。然后，超声波细胞破碎仪探头超声处理脂质体(10 min，工作1 s，间隔1 s)。最后分别经过直径为0.45μm 和0.22μm 聚碳酸酯膜依次挤压后形成IR-775脂质体。

取16只SD 大鼠随机分成4组(每组4只)：①假手术＋IR-775 脂质体组；②I-R＋IR-775 脂质体组；③I-R＋IR-775溶液组；④I-R＋生理盐水组。48 h后处死大鼠，取整个心脏置于IVIS Lumina III活体成像系统箱(激发波长770 nm，发射波长830 nm)内，考察各组大鼠体内荧光信号强度。

1.2.4 评估脂质体药物对大鼠术后心律失常事件的影响 取24 只SD 大鼠，分4 组处理(每组6只)：①I-R＋空白脂质体组；②I-R 组；③I-R＋胺碘酮脂质体组；④I-R＋胺碘酮溶液组。其中胺碘酮药物浓度为2.5 mg/kg。

连续跟踪记录每只大鼠的心电图，再结合MIRI 30 min 后的心电图，使用Cutis and walker(1988)心律失常评分法评估每组大鼠的心律失常事件：房性心律失常或无心律失常—0分；单个室性早搏(简称室早)—1分；频发室早—2分；单次室性心动过速(简称室速)时长＜60 s—3分；一阵室速总时长＞60 s或累计多阵室速总时长＜60 s—4分；多阵室速总时长＞60 s—5分；心室颤动(简称室颤)—6分；室颤时长＞5 min或术中死亡—7分。

1.2.5 评估脂质体药物对大鼠术后细胞凋亡的影响 取24 只SD 大鼠，分4 组处理(每组6只)：①I-R＋空白脂质体组；②假手术＋EP 脂质体组；③I-R＋EP 脂质体组；④I-R＋EP 溶液组；其中EP为50 mg/kg。

48 h后处死大鼠，沿LAD 走向取其供血的左室前壁心肌，剪碎制成心肌组织冷匀浆，置于放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解缓冲液中充分研磨，离心，取上清液，用BCA 试剂盒测定蛋白质浓度。每个蛋白样本取20 u 上样，经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脱脂牛奶封闭约90 min后，分别加入一抗(抗GAPDH 抗体、抗Bax抗体、抗Bcl-2 抗体、抗Caspase-3 抗体)4℃孵育过夜，其中抗GAPDH 抗体作为内部参照；用Tris缓冲盐水和TBST 洗膜后，加入二抗，室温孵育1 h 后再洗膜，最后使用增强化学发光法(enhanced chemiluminescence，ECL)显示膜上的蛋白条带。

1.3 统计学分析

运用SPSS23.0 软件对数据资料进行统计分析，使用One-Way ANOVA 检验和t检验进行数据处理，以P＜0.05为差异具有显著性。

2 结果

2.1 脂质体药物的表征

所制备的脂质体药物粒径均匀(见表1)，制备后24天内药物渗漏不高于18%，稳定性良好。

表1 胺碘酮脂质体与EP脂质体的粒径、zeta电位及粒度分布

2.2 各组荧光信号强度表现

I-R＋IR-775脂质体组荧光强度最高，I-R＋生理盐水组(无荧光信号)，I-R＋IR-775 溶液组和假手术＋IR-775组介于上述二者之间(图1A、1B)。

图1 大鼠心肌I-R 模型IR-775荧光成像图(A)及对应实物图(B)

2.3 大鼠心律失常事件及评分

夹闭LAD 30 min后打开动脉夹，相比于正常心电图，I-R 后心电图观察到T 波高耸、缺血性ST段弓背向上抬高，再灌注后可见室速(见图2)。

图2 MI-IR 手术前后大鼠心电图的演变

I-R＋空白脂质体组、I-R 组、I-R＋胺碘酮脂质体组、I-R＋胺碘酮溶液组的心律失常评分分别为4.0±0.82、4.5±0.96、1.5±0.96、3.0±0.82。与其他三组相比，I-R＋胺碘酮脂质体组心律失常评分明显降低(P＜0.01)，且低于胺碘酮溶液组(P＜0.05)。

2.4 各组凋亡相关蛋白的表达水平

与其他三组相比，I-R＋空白脂质体组的Bax、caspase-3表达水平最高(P＜0.05)，假手术＋EP脂质体组和I-R＋EP脂质体组明显低于I-R＋空白脂质体组和I-R＋EP溶液组；而Bcl-2蛋白正好相反，假手术＋EP脂质体组和I-R＋EP脂质体组表达水平明显高于I-R＋空白脂质体组和I-R＋EP溶液组(P＜0.05)(见图3，表2)。与I-R＋空白脂质体组相比，I-R＋EP 脂质体组的Bax/Bcl-2 比值明显下降。

表2 各组细胞凋亡蛋白的相对表达量的比较

图3 Western Blot法检测相关蛋白的表达

3 讨论

MI-RI是目前急性心肌梗死患者行血运重建术中难以避免的一项难题，探索治疗MI-RI的新方法是本研究的主要内容。LDDS具有诸多优点，可大大改善药物的体内分布和药代动力学特征，不仅使药物具有缓释效果，并且得益于LDDS天然的炎症靶向效应，使药物更多地靶向至病变部位：脂质体药物进入体内后被网状内皮系统吞噬，特别是吞噬细胞，当出现MI-RI时，病变组织释放大量炎症因子，动员和引导包括吞噬细胞在内的大量炎症细胞浸润[6]，从而将所携带的药物传递给病变组织，使药物在病变部位聚集，降低药物副作用的同时，显著提高药物疗效[7]。此外，MI-RI中血管的通透性增加，诱导纳米药物的长滞留效应[8]，增强了脂质体药物在MI-RI的靶向效应。本研究重点考察了LDDS在大鼠MI-RI组织中的靶向效应和独特作用。

在本项研究中，笔者通过结扎SD 大鼠冠状动脉LAD 的方法，制备了SD 大鼠的MI-RI模型，其继发室速的现象与I-R 损伤密切相关，与文献报道的氧自由基堆积[9]和细胞内钙超载[10]等机制下所导致的临床表现一致。在该动物模型上，本研究首先验证了IR-775荧光脂质体在心肌缺血区域的炎症靶向效应，结果证实，与游离IR-775、假手术组对比，IR-775脂质体明显增强了I-R 心肌组织中的荧光信号，这说明在MI-RI区域，脂质体药物确实能发挥炎症靶向作用。

此后，笔者通过胺碘酮脂质体和EP脂质体，考察了LDDS靶向效应的治疗优势。胺碘酮是经典的抗心律失常药物，可用于致命性心律失常的紧急治疗。本研究证实，与游离药物相比，胺碘酮脂质体显著改善了MI-RI心律失常事件评分。

另一方面，EP具有清除氧自由基，减少促炎因子的表达，抑制心肌细胞凋亡的作用[5，11]，因此，本研究也通过EP脂质体评估了靶向效应对MI-RI区域凋亡蛋白的影响。

Bcl-2家族蛋白是调控细胞凋亡的关键因素之一[12－13]，尤其Bax与Bcl-2的比值与细胞凋亡水平密切相关：当Bax/Bcl-2 比值增高时，促进细胞凋亡，反之，则抑制细胞凋亡[14]。而Caspase-3被认为是细胞凋亡过程中最重要的终末剪切酶，Caspase-3激活和超表达均可诱导细胞凋亡[15]。因此，Bax、Bcl-2、Caspase-3，及Bax/Bcl-2 比值都可以作为评价细胞凋亡的重要指标。

本研究结果显示，与对照组相比，EP脂质体均显著降低了MI-RI中Bax蛋白、Caspase-3 表达水平，而Bcl-2 表达水平明显增高，Bax/Bcl-2 比值显著下降；与游离药物相比，LDDS增强了对上述凋亡蛋白表达的影响。因此，LDDS增强了EP在MI-RI中对细胞凋亡的调控作用，减轻了I-R 损伤。

通过该项研究，证实LDDS可在MI-RI中发挥炎症靶向效应，并借助于该效应，可使相关药物进一步改善MI-RI对心脏的不利影响，增强治疗效果，或许是一种治疗MI-RI的新策略。