王曦敏 李续玲 仉晓红 张明 李展 王海燕 侯应龙

心脏生理功能的实现需要充足的血液供应与精密的神经支配。其中支配心脏的交感与迷走神经以心房神经丛的方式分布在心脏表面大血管附近的脂肪垫中[1]。这些神经丛不仅能够显著影响附近心房组织的电与机械活动，同时也影响其靶心房组织的神经营养支配。针对射频消融治疗心房颤动(简称房颤)的各种手术方式消融后除了完成肺静脉-左房之间的电隔离、消除房颤维持的基质外，同时也均实现了经意或不经意的不同程度的去神经作用，并可能影响其所支配区域心房组织的结构与功能。笔者前期研究也证实：针对犬右上与右下心房神经丛消融后，与消融即刻相比，远期(6月与12月)心房有效不应期恢复到消融前水平且房颤易诱发，这一现象与心房出现显著的神经萌发及交感、迷走神经的分布不平衡有关[2]。然而，神经丛消融导致的心房去神经化是否对靶心房肌组织存在不良影响，后者是否成为房颤远期复发的新的潜在因素，目前尚不清楚。据此，本研究旨在通过构建神经丛消融犬模型来观察心房去神经支配对靶心房组织超微结构的远期影响，试图寻求临床实践中射频消融后房颤复发新的潜在线索。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取32 只雄性杂种犬(16～20 kg/只，购自山东大学实验动物中心)，随机分为4组，每组8只。通过Lead 7000电生理仪监测和记录，实验设计和实施均通过了山东第一医科大学第一附属医院伦理委员会审批。

1.2 神经丛消融犬模型建立 第1组(对照组，n＝8)于右侧第四肋间行开胸手术，未进行神经丛消融，而第2～4组(消融组，每组n＝8)在右侧第四肋间开胸后行右上及右下神经丛消融。术后观察第1、2组1个月，第3组6个月，第4组12个月。静脉注射3%戊巴比妥钠麻醉，气管插管，维持正压通气，然后在每小时结束时追加剂量1 mg/kg；术后给犬注射镇痛药。在无菌手术条件下，于右侧第四肋间开胸，充分暴露心房及右上、右下神经丛。解剖定位：右上神经丛位于右肺静脉、上腔静脉与右房交界处的脂肪垫内；右下神经丛位于下腔静脉与左右心房交界处。确定好脂肪垫位置后，取射频消融电极(7F，尖端4 mm)连接射频消融仪，对右上及右下神经丛行消融，每个点消融15～20 s(20 Hz 0.1 ms 2～5 V)，一边消融一边用冰盐水冲洗避免局部温度过高造成组织损伤。消融成功标准：高频刺激(20 Hz 0.1 ms 2～5 V)消融后的神经丛区域时，不再出现窦性心律减慢及房室传导间期延长。

在研究结束时，一共有29只犬完成所需研究，1只因麻醉过量致死，1只因术后严重感染死去，第3只死于腹泻。最终组1(对照组)有7只犬，组2～3分别有8只，组4有6只。

1.3 组织处理 根据Yuan等[3]报道，在犬的心脏内在自主神经系统中，心脏神经节与周围0.5～2 cm 之间的心房组织形成完整的神经丛环路。据此，笔者选定距离消融神经丛区域1 cm 以内的心房肌组织为靶区域。造模结束后，应用戊巴比妥钠处死后，取出心脏，分别选取右上、右下神经丛周围的靶心房组织，切割成体积约1 mm3大小的立方体，固定于2.5%的戊二醛中，4℃保存2 h以上至组织完全固定，1 mmol/L 的磷酸缓冲液冲洗，1%四氧化俄固定4℃2 h，包埋于环氧树脂中，包埋液固化，醋酸铀染色后于透射电镜(JEOL JEM－1200EX，日本电子公司)下观察、拍片。采用1＋至3＋评分法对各组心肌细胞及心肌间质损伤程度进行半定量评分。

2 结果

第1组(对照组)犬靶心房肌透射电镜观察可见心肌细胞质膜完整，高度排列有序的肌丝，闰盘清晰可见，与形态正常大小密度均一的线粒体和肌浆网有序的分布。心肌间质无异常改变，无胶原沉着(图1A)。

第2组(消融1个月)靶心房肌出现明显的超微结构异常改变(图1B)。透射电镜下观察，心房肌细胞明显肿胀、变小，膜性细胞器较少。线粒体也表现出形态异常，包括嵴膜肿胀、空泡及不连续。胞内间隙增大，质膜破坏，间盘解体。心脏间质无明显胶原沉积。

第3组(消融6个月)靶心房肌也呈现出显著异常改变(图1C)，大部分肌节排列不规则，肌节明显长于邻近的肌细胞。肌节表现出收缩或扩张的差异，肌丝结构消失，肌原纤维与线粒体之间规律排列的形式已不复存在。线粒体肿胀异常，闰盘结构扭曲，心肌间质可见胶原纤维聚集。

第4组(消融12个月)靶心房肌组织也出现显著的超微结构异常(图1D)。心肌细胞总体形态与3组相似。细胞水肿，线粒体部分明显肿胀，嵴碎裂，闰盘在结构上也出现了扭曲。然而，观察到严重的间质胶原沉积和相对较少的受损细胞器，表明修复正在进行。

4组的半定量评分见表1。

表1 各组电子显微镜检查半定量分析

3 讨论

本研究的主要发现，不论是心房神经丛消融后的急性期，还是远期模型犬中均观察到靶心房肌组织显著的超微结构异常改变，包括线粒体肿胀、空泡，糖原聚集，膜性细胞器减少，心肌间质胶原沉积随时间增加，损伤组织被纤维组织取代。这可能是一种有重要潜在意义的发现。

神经丛消融后靶心房组织超微结构损伤改变的机制目前不甚清楚，可能包括以下几个因素：①神经丛消融后的炎症反应。Schwartzman 等[4]观察发现，对猪行单纯的心房线性消融后，炎症引起的右房壁组织水肿发展迅速，并在消融后4周内消退。但笔者的研究发现，消融后1个月心房超微结构损伤严重，12个月后仍未恢复正常水平。据报道，神经丛刺激可显著减少术后炎症细胞因子的释放[4]，而神经丛消融导致的自主神经系统失衡，可能诱发炎症反应，后者可进一步引起细胞肥大、凋亡和坏死，进而引发心房超微结构损伤和心房间质纤维化。②心房去神经支配。Havranek等[6]报道了射频消融术后左房壁的水肿变化通常延伸到远离肺静脉消融区域，这些区域并没有受到射频消融能量的直接影响。同样的，所获得的靶心房组织区域也是消融热量难以到达的部位，但电镜下所呈现的心肌超微结构却发生显著损伤性改变。

迄今为止，导致发生上述变化的机制仍不清楚。推测心房去神经支配可能是造成这些变化的原因。众所周知，心脏自主神经系统形成了由多个神经丛和Marshall韧带组成的相互连接的神经网络。这些神经丛通常嵌入位于心外膜的脂肪垫中，调节和影响心肌内神经递质的释放[7]，以及附近心房组织的功能[8]。动物实验表明，心脏内在自主神经系统释放的乙酰胆碱可以引起心房复杂碎裂电位激活[9]。本研究中消融部位及临床上的房颤消融术式，其消融区域往往都是神经丛和神经纤维分布最集中、最密集的部位，消融后除了完成肺静脉-左房之间的电隔离、消除房颤维持的基质外，同时也均实现了经意或不经意的不同程度的去神经作用。大量研究表明，周围神经损伤后，失神经骨骼肌会出现体积缩小、收缩功能丧失等肌萎缩现象，肌纤维萎缩的同时存在广泛的纤维化。在本研究中，也观察到神经丛消融导致心房肌肉去神经支配的这种慢性损伤，导致靶组织周围细胞外基质的过度产生和积累。由于心房神经丛具有复杂的神经化学解剖结构，具有显著影响心肌功能和调节心肌营养的副交感神经和交感神经元，因此推测上述现象可能是由于神经元到靶心房组织的突触传递中断所致。除了上述机制外，免疫反应和Ca2＋超载可能会导致靶心房的超微结构损伤，但这些解释迫切需要进一步研究证实。

在过去的约30年中，房颤射频消融逐渐成为维持窦性心律的一种重要的非药物治疗方法[10]。对于阵发性房颤患者，尽管射频消融的首次成功率达到了70%～80%，但依然有不少患者在射频消融后房颤再发，并成为影响房颤射频消融远期获益的的重要因素。而持续性房颤的消融成功率更低，复发率更高。在Schreiber等[11]的一项研究中，493 名持续性房颤患者接受了导管消融术。单次和多次手术成功率分别为20.1%和55.9%，且消融后房颤复发率随时间增加。以往的研究表明，单次导管射频消融成功的患者中约有40%在随后的3年内复发房颤，20%～30%的患者需要多次消融术[12－14]。笔者前期动物实验发现，犬神经丛消融远期房颤诱发率增加[2]。就房颤复发的机制而言，环肺静脉隔离的不连续性和非透壁损伤引起的电传导恢复是一个重要因素，在本研究中，从透射电镜下观察，消融后即刻及远期均可出现线粒体形态异常、心肌细胞肌原纤维排列紊乱、闰盘不连续、并出现糖原聚集、心肌间质纤维化。这种射频消融后心房去神经支配引起的心房组织超微结构损伤，是否能够为无法解释的临床房颤消融后复发提供新的线索，值得关注。

有趣的是，一项多中心、前瞻性、观察性队列研究对260名房颤患者在消融前接受延迟增强MRI成像检测，发现左房纤维化每增加1%，射频消融术后房颤复发率增加15.3%[15]。本研究发现，射频消融远期消融区周围失神经支配的靶心房肌发生纤维化，而心房纤维化则是影响房颤复发的强烈潜在因素[16]，心肌纤维化破坏心肌细胞偶联的过程，导致细胞束之间细胞外基质扩张，改变了心房超微结构逐渐形成房颤发生的基质。然而，心房去神经支配与心房组织纤维化之间的关系仍不清楚。许多基础和临床研究表明，神经损伤等因素引起的去神经支配不仅会导致神经支配区肌肉组织萎缩，还会改变多种神经生长因子的表达水平，如GDNF、BDNF、NT3、NT4、NGF[17]。一些神经生长因子不仅参与调节细胞增殖、分化和神经元的髓鞘形成，而且在生物体中发挥着更广泛的作用，如促进多种内脏纤维化的发生[18]。进一步阐明心房去神经作用与房颤远期复发及其确切机制是我们未来面临的重要研究课题。