张 莉 张 勇 雷星宇 张渊海 张逸妍 彭选明 杨 震

(湖南省农业科学院核农学与航天育种研究所，湖南 长沙 410125)

随着人类日益增长的粮食需求，水稻作为重要的粮食作物，其增产、稳产对国民经济发展具有重要影响。辐射诱变育种技术利用X、γ、α、β射线或中子等照射生物体，改变其遗传物质，使后代出现新的变异，再从中筛选和培育新种质和新品种。根据照射方式，辐射诱变可分为内照射和外照射。目前外照射方法被广泛应用，处理对象包括各种作物的种子、花粉、幼穗等[1]。辐射诱变育种技术在我国农作物突变种质资源创制、新品种培育等应用领域取得了一批重要成果，在保障国家粮食安全、推进农业绿色发展方面发挥了独特作用。我国育种家利用空间环境诱变水稻种子，培育出了航恢7号、航香10号、湘辐259、华航311号、Y两优1173等多个抗稻瘟病恢复系、新资源和新组合[2]。李强等[3]使用N离子束注入连麦6号，发现剂量为6×1017N+·cm-2时，第2代种子突变频率最高，总突变率达11.02%，筛选到3个超亲变异性状(矮杆多蘖、早熟性、大穗)植株，丰富了种质资源。李博等[4]采用5种不同剂量7Li离子束注入对大麦进行诱变处理，发现在30 Gy剂量处理下，粒型变异幅度最大，50 Gy剂量下，品质变异幅度最大，且30 Gy剂量处理获得的极端突变体最多，并能获得较为理想的变异。

高通量测序技术正向着高通量、低成本、长读取长度的方向发展，其中转录组测序技术(ribonucleic acid-sequencing, RNA-seq)日渐成熟。基于新一代高通量测序技术的小RNA(small RNA)测序，可一次性获得数百万条小RNA序列，能够快速地鉴定某种组织在特定状态下的所有已知小RNA并发现新的小RNA，为小RNA功能研究提供了有力工具。小RNA是生物体内一类重要的功能分子，其主要功能是诱导基因沉默，调控细胞生长、发育、基因转录和翻译等生物学过程。小RNA根据其起源、结构，关联蛋白和生物作用可分为三类：短干扰RNA(short-interferina RNA, siRNA)、微小RNA(micro RNA, miRNA)和PIWI蛋白互作RNA(PIWI-interacting RNA, piRNA)[5-6]。在这些小RNA中，miRNA是内源性的20～24 nt长的非编码实体，广泛存在于真核生物中[7-8]。这些miRNA在转录和转录后水平上调控基因表达[9]，在植物生长发育中发挥重要作用[6,10-11]。miRBase(http://mirbase.org/)发布了24 521 个miRNA位点，共生产出30 424个成熟miRNA产物，属于206个种属[12]。

近年来，随着现代分子生物学技术的进步，辐射诱变突变体的遗传及突变机制研究正在逐步开展，在细胞水平上主要阐述染色体畸形和突变的关系，在分子水平上围绕DNA损伤、修复及其与突变的关系开展研究[13]，而损伤效应在RNA以及蛋白质水平上的研究报道相对较少。为探讨不同剂量下60Co-γ射线辐射后的损伤效应在水稻小RNA水平上的差异，本研究采用Illumina HiSeq高通量测序方法对不同剂量辐射后的高粳糯品种三叶期叶片进行小RNA转录组测序及相关分析，以期从转录水平为水稻辐射诱变引起的苗期损伤效应的分子机理研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料与诱变方法

水稻高粳糯品种是湖南湘西自治州农家种植的糯稻品种，植株过高，成熟后期易倒伏。为获得矮化植株变异突变体，将其干种子在湖南省农业科学院核农学与航天育种研究所湖南辐照中心进行60Co-γ射线辐射处理，辐射剂量为0(CK)、300(Gy3)、400 Gy(Gy4)，平均剂量率为8.37 Gy·min-1。将辐射后的种子浸种催芽，播种到水稻田土盆(35 cm×25 cm×5 cm)中，每盆6株×6行，共3盆。光温生长箱中生长(10 h/14 h，光/暗，光照强度10 000 Lx)，定期浇水。取三叶期叶片，20株为1个重复，共3个生物学重复，采集后的叶片浸泡于液氮中保存。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA提取和纯度检测、小RNA文库构建、Illumina测序 根据RNAiso Plus[宝生物工程(大连)有限公司]提取试剂盒的说明，从组织样本中分离出总RNA，部分步骤稍作修改。在1%琼脂糖凝胶上监测RNA降解和污染，送至北京诺禾致源科技股份有限公司检测纯度。RNA浓度由Qubit 2.0荧光计(美国Life Technologies公司)测量，完整性由2100安捷伦生物分析仪(美国安捷伦有限公司)评估。纯化后的RNA用于构建小RNA文库，并在Illumina HiSeqTM2500/MiSeq测序平台(北京诺禾致源科技股份有限公司)进行测序。

1.2.2 测序数据处理分析 测序得到的原始读取序列(raw reads)去除含有带接头的、低质量的读取序列(reads)，得到过滤序列(clean reads)。筛选出序列长度为18～40 nt的小RNA用于进一步分析。使用Bowtie软件[14]将筛选后的小RNA定位到参考序列上，分析小RNA在参考序列上的分布。将上述比对到参考序列上的reads，用miRBase20.0搜索已知的miRNA[15]。整合miREvo[16]和mirdeep2[17]这些miRNA预测软件来进行新miRNA的分析；用水稻非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)序列注释测得的小RNA分析ncRNA，用水稻重复序列信息注释测得小RNA分析重复序列，用PlantNATsDB(http://bis.zju.edu.cn/pnatdb/)检测天然反义转录段干扰RNA(Natural Antisense Transcripts-siRNA，NAT-siRNA.)，反式短干扰RNA(Trans Acting Short-interfering RNA，TAS-iRNA)分析采用水稻和拟南芥已知TAS基因为数据库进行同源比对，运用顺式元件短干扰RNA(ta-siRNA，trans-acting siRNA)识别软件UEA sRNA tools[18]来进行TAS预测；对各样本中已知和新miRNA进行表达量统计，并用TPM[19]进行表达量归一化处理；采用基于负二项分布的DESeq2[20]进行差异表达的miRNAs分析。用火山图可以推断差异miRNA的整体分布情况，从差异倍数(fold change)和校正后的显著水平(Padj，q值)两个水平进行评估。默认差异miRNA的筛选条件为：Padj<0.05；将psRobot.tar运用到psRobot软件[21]中预测miRNAs的靶基因。

1.2.3 GO富集和KEGG通路分析 GO(Gene Ontology)富集分析方法为GOseq[22]；KEGG[23](Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是有关Pathway的主要公共数据库，以候选靶基因KEGG富集散点图表示KEGG富集分析结果，通过Rich factor、q值和富集到此通路上的基因个数来衡量，Rich factor越大，表示富集的程度越大。q值是做过多重假设检验校正之后的P值，q值的取值范围为[0，1]，越接近于零，表示富集越显著。

2 结果与分析

2.1 测序数据总结

Gy3、Gy4及对照组样品clean data分别达到98.42%、94.98%以及96.67%，碱基GC含量均在50%以上，Q30碱基百分比均在97.3%及以上，说明测序质量良好，可进行后续分析(表1)。从clean data中选取长度在18～30 nt的小RNA序列作进一步研究，对照组小RNA的表达频率分布前四位分别为18.98%(24 nt)、9.99%(29 nt)、9.71%(30 nt)、8.73%(28 nt)；Gy3处理组中表达频率分布前四位分别为17.94%(24 nt)、9.33%(20 nt)、8.90%(25 nt)、7.91%(23 nt)；Gy4处理组中表达频率分布前四位分别为19.55%(24 nt)、9.39%(20 nt)、8.19%(29 nt)、7.78%(21 nt)(图1)，24 nt的小RNA明显高于其他长度的小RNA，经γ射线处理后高粳糯20-25 nt小RNA所占比例有所增加。

图1 不同剂量下高粳糯的小RNA长度分布Fig.1 Length distribution of small RNA under different doses treated Gaogengnuo

表1 测序数据小结Table 1 Summary of resequencing data

一般情况下，质量较好的植物样品中rRNA总量所占比例应低于60%。由表2可知，3个处理rRNA总量均远低于60%。天然反义转录物(natural antisense transcripts，NAT)是指可以跟其他转录本互补形成RNA双链的编码或非编码RNA序列，对照组中NAT所占比例为17.20%，Gy3和Gy4组NAT占比分别为20.66%和19.84%，两种剂量辐射处理后NAT比例都有所增加。对照组新的miRNAs有863个，Gy3有1 203个，Gy4有867个，300 Gy处理下较对照增加了340个新miRNAs。未被注释序列占比随着辐射剂量的增加而增加。外显子中的小RNA多位于正链，内含子的小RNA则多位于负链。

表2 小RNA种类和数量汇总Table 2 Summary of small RNA types and amount

2.2 已知和新miRNA鉴定

对小RNA文库进行搜索来识别已知的miRNA，经过BLASTN搜索和序列分析，Gy3处理中共有312个已知前体，265个miRNA成熟序列；Gy4中共有315个已知前体，261个miRNA成熟序列。miRNA前体，能够用来预测新的miRNA，在对照中检测到31个已知前体，26个miRNA成熟序列，Gy3中共有34个已知前体，29个miRNA成熟序列，Gy4中共有34个已知前体，29个miRNA成熟序列(表3)。其中novel_209、novel_279、novel_91这3个新miRNA只在辐射处理之后的高粳糯中被检测到，novel_261在3种处理中均是数目最多的新miRNA，其次是novel_34。与对照相比，Gy3处理使得相同类型新miRNA数量增多(表4)。

表3 已知和新预测的miRNATable 3 Known and novel miRNA

表4 新miRNA序列和数目Table 4 Sequence and number of novel miRNA

2.3 新预测miRNA的首位碱基偏好性

miRNA在由前体发育为成熟体时，其过程是由Dicer酶切完成的，酶切位点的特异性使得miRNA成熟体序列首位碱基具有很强的偏向性。通过分析不同长度miRNA的首位点碱基分布，发现在新miRNA中3种处理组24 nt的miRNA占绝大多数，其首位碱基位点是A，18 nt和19 nt长度的miRNA中100%都是5′U为首位酶切位点。对照组中24～27 nt长度的新miRNA以5′A首位酶切位点占主要比例；Gy3处理组中20 nt、28～29 nt与18～19 nt长度的新miRNA的首位碱基酶切位点相同，100%都是U，在30 nt时则都是G；Gy4处理组中28 nt与18～19 nt长度的新miRNA的首位碱基酶切位点相同，100%都是U，在29 nt时则都是A(图2)。新miRNA中24 nt的miRNA在Gy3处理组中较对照增加了290个，在Gy4处理组中较对照减少了81个。

图2 新预测miRNA的首位碱基偏好性Fig.2 The first nucleotide bias of novel miRNA

2.4 差异miRNA分析鉴定

两两比较3个处理组文库中miRNA的标准化表达水平，以识别差异表达miRNA。差异miRNA筛选条件为：q值<0.01，| log2(foldchange)|>1。维恩图分析结果显示Gy3 vs CK比较组有68个差异miRNA，包括61个已知miRNA和7个新的miRNA(novel_149、novel_205、novel_232、novel_238、novel_288、novel_43、novel_95)； Gy4 vs CK比较组有65个差异miRNA，包括60个已知miRNA和5个新的miRNA(novel_100、novel_102、novel_150、novel_261、novel_63)；Gy3 vs CK与Gy4 vs CK再进行差异比较，有86个差异miRNA，包括79个已知miRNA和7个新miRNA(novel_184、novel_195、novel_209、novel_240、novel_279、novel_90、novel_91)(图3-a)。火山图显示Gy3 vs CK比较组有154个表达差异，其中Gy3中有88个上调，66个下调；Gy4 vs CK比较组有151个表达差异，其中Gy4中有75个上调，76个下调；Gy3 vs Gy4再进行差异比较，有86个上调，68个下调表达(图3-b、c、d)。

注：a：Gy3 vs CK和Gy4 vs CK差异miRNA维恩图，每个圈里的数字代表相应样本间的差异miRNAs，重叠部分代表共同的差异miRNAs；b、c、d代表Gy3 vs CK、Gy4 vs CK和Gy3 vs Gy4的差异miRNA火山图，正三角和倒三角分别代不同比较组中上调和下调的miRNAs，黑点代表无显著差异。Note: a:The Veen diagram of differentially expressed miRNAs of Gy3 vs CK, Gy4 vs CK. The number in each circlerepresented the expressed miRNAs in the corresponding sample, and in the overlapping part of the circles represented the co-expressed miRNAs. b, c, d: Dare volcanic diagram of differentially expressed miRNA in Gy3 vs CK, Gy4 vs CK and Gy3 vs Gy4. The regular triangle and inverted triangle represented significantly up-regulated and down-regulated miRNAs, the black dots represented no significant difference.图3 3个处理组比较差异miRNAsFig.3 The differentially expressed miRNAs in three treatments

2.5 差异miRNA候选靶基因GO分析

将CK、Gy3和Gy4分别两两比较，得到差异表达miRNA，根据miRNA与其靶基因间的对应关系，对每组差异表达miRNA的靶基因的集合进行GO分析。Gy3和CK相比较没有显著差异的miRNA，无需进行GO分析。Gy4和CK的差异miRNA的靶基因进行GO分析，如图4所示，差异显著的靶基因均涉及生物过程、细胞组分、分子功能三大类，但分子功能所占基因数目最多。其中生物过程中共有20个小类型，前三类分别是羧酸代谢过程(51)、酮酸代谢过程(51)和有机酸代谢过程(51)。连续的分析表明，靶基因在功能上高度多样化。在细胞组件方面，将基因分成18个小类，其中前三类分别是细胞质(96)、细胞器部分(75)和细胞内细胞器部分(74)。在分子功能方面共有20个小类型，前三类分别是分子功能(619)、离子结合(253)和蛋白质结合(184)。总结三种类型，分子功能的基因最多，其次是结合和代谢，可能这些差异miRNA与代谢密切相关。Gy3和Gy4两种剂量处理组比较差异miRNA所涉及的靶基因富集如图5所示，只富集到生物过程和分子功能，其中生物过程又分为2个小类共27个基因，DNA组装(13)和DNA构象变化(14)。分子功能分为5个小类共527个基因，离子结合(252)、过渡金属离子结合(137)、氧化还原酶活性(82)、电子载体活性(25)、铜离子结合(31)。可能这些差异miRNA涉及生物体内氧化还原反应。

注：1：氨酰化丝氨酰tRNA；2：蛋白质翻译的tRNA氨酰化；3：氨基酸活化作用；4：tRNA氨酰化；5：细胞氨基酸代谢过程；6：tRNA代谢过程；7：DNA组装；8：羧酸代谢过程；9：酮酸代谢过程；10：有机酸代谢过程；11：ncRNA代谢过程；12：DNA构象变化；13：正调控分解代谢过程；14：正调控自噬；15：细胞分解代谢过程正调控；16：细胞分解代谢过程调控；17：自噬调控；18：分解代谢过程调控；19：发病机理；20：自噬；21：中间丝状体；22：中间纤维细胞骨架；23：膜的外在成分；24：部分细胞骨架；25：细胞骨架；26：转运质子的v型ATP酶，V0结构域；27：转运质子的v型ATP酶复合物；28：细胞质；29：细胞内无膜边界细胞器；30：无膜边界细胞器；31：基膜；32：细胞外基质成分；33：细胞器部分；34：细胞内细胞器部分；35：蛋白质的细胞外基质；36：二扇形ATP酶复合物，质子转运域；37：内膜系统；38：细胞外基质；39：动力蛋白结合；40：蛋白质同源二聚化活性；41：同源蛋白结合；42：丝氨酸tRNA连接酶活性；43：转录因子结合；44：氨酰连接酶活性；45：连接酶活性，形成碳氧键；46：连接酶活性，形成氨酰tRNA及相关化合物；47：蛋白质二聚化活性；48：未折叠蛋白结合；49：连接酶活性；50：铜离子结合；51：电子载体活性；52：序列特异性DNA结合；53：核酸结合转录因子活性；54：转录因子活性，序列特异性DNA结合；55：分子功能；56：细 胞骨架蛋白结合；57：离子结合；58：蛋白结合。BP：生物过程；CC：细胞组分；MF：分子功能。Note: 1: Seryl-tRNA aminoacylation. 2: tRNA aminoacylation for protein translation. 3: Amino acid activation. 4: tRNA aminoacylation. 5: Cellular amino acid metabolic process. 6: tRNA metabolic process. 7: DNA packaging. 8: Carboxylic acid metabolic process. 9: Oxoacid metabolic process. 10: Organic acid metabolic process. 11: ncRNA metabolic process. 12: DNA conformation change. 13: Positive regulation of catabolic process. 14: Positive regulation of autophagy. 15: Positive regulation of cellular catabolic process. 16: Regulation of cellular catabolic process. 17: Regulation of autophagy. 18: Regulation of catabolic process. 19: Pathogenesis. 20: Autophagy. 21: Intermediate filament. 22: Intermediate filament cytoskeleton. 23: Extrinsic component of membrane. 24: Cytoskeletal part. 25: Cytoskeleton. 26: Proton-transporting Ⅴ-type ATPase, V0 domain. 27: Proton-transporting Ⅴ-type ATPase complex. 28: Cytoplasm. 29: Intracellular non-membrane-bounded organelle. 30: Non-membrane-bounded organelle. 31: Basement membrane. 32: Extracellular matrix component. 33: organelle part. 34: Intracellular organelle part. 35: Proteinaceous extracellular matrix. 36: Proton-transporting two-sector ATPase complex, proton-transporting domain. 37: Endomembrane system. 38: Extracellular matrix. 39: Dynein binding. 40: Protein homodimerization activity. 41: Identical protein binding. 42: Serine-tRNA ligase activity. 43: Transcription factor binding. 44: Aminoacyl-tRNA ligase activity. 45: Ligase activity, forming carbon-oxygen bonds. 46: Ligase activity, forming aminoacyl-tRNA and related compounds. 47: Protein dimerization activity. 48: Unfolded protein binding. 49: Ligase activity. 50: copper ion binding. 51: Electron carrier activity. 52: Sequence-specific DNA binding. 53: Nucleic acid binding transcription factor activity. 54: Transcription factor activity, sequence-specific DNA binding. 55: Molecular function. 56: Cytoskeletal protein binding. 57: Ion binding. 58: Protein binding. BP: Biological Process. CC: CellularComponent. MF: Molecular Function.图4 Gy4 vs CK的GO富集图Fig.4 Gene ontology terms for differentially expressed miRNAs in Gy4 vs CK

注：1：DNA组装；2：DNA构象变化；3：铜离子结合；4：电子载体活性；5：氧化还原酶活性；6：过渡离子结合；7：离子结合。Note: 1: DNA packaging. 2: DNA conformation change. 3: Copper ion binding. 4: Electron carrier activity. 5: Oxidoreductase activity. 6: Transition metal ion binding. 7: Ion binding.图5 Gy3 vs Gy4差异miRNA的GO富集图Fig.5 Gene ontology terms for differentially expressed miRNAs in Gy3 vs Gy4

2.6 差异miRNA候选靶基因KEGG富集分析

生物体内不同基因相互协调行使其生物学功能，通过途径显著性富集能确定候选靶基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。将Gy3 vs CK、Gy4 vs CK、 Gy3 vs Gy4 的差异miRNA对应的靶基因进行KEGG富集分析，结果以候选靶基因KEGG富集散点图方式展示(图6)，Gy3 vs CK组富集到的前20条途径中植物病原互作在基因数量方面富集程度最高(8个基因)，其次是过氧物酶体(7个基因)和内吞作用(7个基因)；富集最显著的则是植物昼夜节律，q值为0.49，有5个候选基因。Gy4 vs CK组富集到的前20条途径中代谢途径在基因数量方面富集程度最高(57个基因)，其次是甘油磷脂代谢(8个基因)、精氨酸和脯氨酸代谢(6个基因)、真核生物的核糖体发生(6个基因)和内吞作用(6个基因)；富集最显著的则是甘油磷脂代谢和醚脂类代谢，q值均为0.12，其中醚脂类代谢有5个候选基因。Gy3 vs Gy4组富集到的前20条途径中甘油磷脂代谢、真核生物的核糖体发生和内吞作用在基因数量方面富集程度最高(7个基因)，其次是醚脂类代谢(6个基因)；富集最显著的是醚脂类代谢，q值为0.02，其次是甘油磷脂代谢和氨腈酸代谢，q值为0.35。

注：q值的颜色表示富集因子的显著性，圆圈表示所涉及的靶基因，大小为与基因数量成正比。Note: The coloring of the q-values indicates thesignificance of the rich factor; the circle indicates the target genes that are involved, and the size isproportional to the gene number.图6 差异miRNA的KEGG分类图Fig.6 KEGG pathway of the differentially expressed miRNAs

3 讨论

目前，转录组测序和从头组装是获取高通量转录本序列最快速有效的方法，并成功应用于新基因发现、功能基因定位和分子标记开发[24-25]。水稻常规品种高粳糯株高约150 cm，为创制矮化株型的突变体，对高粳糯干种子进行不同剂量γ射线辐射处理，辐射后在M1代的苗期都出现了不同程度的损伤效应。目前基于植物辐射诱变引起当代苗期损伤效应的分子机理研究报道相对较少，本研究在RNA转录水平上探讨和分析诱变引起的损伤效应，以期为辐射诱变育种技术提供理论支撑。

基于高通量测序技术的小RNA测序已经在许多物种中展开，Xu等[26]对嗜水气单胞菌敏感(susceptible grass carp, SGC)和耐水草鱼(resistant grass carp, RGC)进行sRNA测序，共鉴定出61个保守miRNA和124个候选新miRNA以及21个差异miRNA。He等[27]分别构建了白肉甘薯(xusshu-18)和紫肉甘薯(xuzshu-3)小RNA和降解组文库。小RNA测序共鉴定出191个已知miRNAs和33个新miRNA，降解组测序鉴定出115个已知i-miRNAs和5个新i-miRNAs切割的180个靶基因，有121个差异miRNA，综合分析发现有26个差异表达的miRNA和36个相应的靶点可能参与花青素的生物合成。水稻根系盐胁迫响应miRNA和tRF的鉴定：孟淑君等[28]共检测到12种水稻根系中盐胁迫响应miRNA，靶基因多为转录因子编码基因，推测其通过对其靶基因转录因子的转录后调控参与了盐胁迫响应的表达调控。本研究中Gy3 处理共鉴定出265个已知miRNA成熟序列，29个新的miRNA成熟序列；Gy4处理共鉴定出261个已知miRNA成熟序列，29个新miRNA成熟序列，两种剂量处理后对已知miRNA和新的miRNA的贡献均等，与对照组相比均略增加。推测300 Gy 辐射剂量更适合发掘新的miRNA，400 Gy辐射剂量更适合发掘已知miRNA。Gy3 vs CK组有154个差异miRNA，Gy4 vs CK组有151个差异miRNA，在这些差异表达基因中，有很多miRNA家族在其他物种中也被报道如oa-miR397和osa-miR168。如红花miR397a的表达可增强植物对NaCl的敏感性[29]；mir168b突变体表现出脱落酸低敏性和干旱超敏性[30]。辐射后的高粳糯可能对某些非生物胁迫表现出一定的敏感性。

γ射线辐射生物体后，生物体产生过量自由基不能及时清除，从而引起辐射损伤[31]。何颖等[32]发现低剂量γ射线辐射后的大鼠血清代谢产物发生变化，主要涉及免疫功能、能量代谢、糖代谢和脂代谢。水稻在经γ射线辐射后在当代苗期出现不同程度损伤效应，生长后期损伤效应逐渐恢复，可能涉及某些基因通过调节表达量来迅速应对外界胁迫效应，采用生物信息学对辐射后的高粳糯差异基因涉及途径分析，Gy4和CK的差异miRNA靶基因富集到的分子功能的基因最多，其次是结合和代谢，可能这些差异miRNA与代谢密切相关。通过KEGG富集分析，Gy4 vs CK组代谢途径富集程度最高，富集最显著的是甘油磷脂代谢和醚脂类代谢。Gy3 vs Gy4组甘油磷脂代谢、真核生物的核糖体发生和内吞作用在基因数量方面富集程度最高，富集最显著的是醚脂类代谢，可见辐射处理相对更多影响高粳糯参与代谢活动的基因。60Co-γ辐射可能通过影响水稻幼苗甘油磷酸酯代谢和醚脂类代谢抑制了其生长发育。下一步工作将结合相关突变体表型开展候选基因的表达量验证，以期克隆发现相关基因。

4 结论

利用高通量测序平台对不同剂量γ射线辐射后的水稻品种高粳糯进行小RNA测序。300 Gy和400 Gy剂量处理后对已知miRNA和新miRNA的贡献均等，与对照组相比均有少量增加。GO聚类分析结果显示Gy4 vs CK的差异靶基因在分子功能的基因最多。Gy3 vs Gy4组差异靶基因以离子结合占主要比例。KEGG显示Gy3 vs CK组集中在植物病原互作和植物昼夜节律途径；Gy4 vs CK组集中在代谢途径；Gy3 vs Gy4组集中在甘油磷脂代谢和醚脂类代谢途径。本研究从RNA水平变异的角度分析辐射诱变对水稻的影响，以期为进一步研究辐射诱变引起水稻当代苗期的损伤效应提供一种新途径。