严 云 李博怿 王雅琦 赵蔚波 董丽丹 郑燕飞

北京中医药大学，国家中医体质与治未病研究院（北京 100029）

勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）指男子在性刺激下，阴茎持续地不能达到或维持足够硬度的勃起以完成满意性生活，病程达3 个月以上[1]。中医将ED称为 “阳痿”。疏肝益阳胶囊是中医男科学的创始人之一、学科带头人王琦院士根据 “阳痿从肝论治” 的理论研制的，由蒺藜、柴胡、蜂房等15 味中药组成[2]。前期动物实验和临床实验均证实疏肝益阳胶囊可显著改善勃起功能，尤其对心理性及轻度动脉性勃起功能障碍具有良好疗效[3]。本研究利用网络药理学方法研究疏肝益阳胶囊治疗ED 的作用机制，为后续进行疏肝益阳胶囊治疗ED 的科学研究提供理论参考，并降低筛选靶点和作用通路所需的研究成本。

资料与方法

一、疏肝益阳胶囊活性成分收集与靶点预测

通过TCMSP[4]（https://tcmspw.com/tcmsp.php）、中国天然产物化学成分库（http://pharmdata.ncmi.cn/cnpc）和TCMID[5]（http://119.3.41.228:8000/tcmid）等数据库对疏肝益阳胶囊的化学成分进行收集，并检索相关文献[6-9]作为补充。再利用TCMSP 收集这些化学成分所对应的靶点蛋白，最后利用UniProt[10]（https://www.uniprot.org）数据库，将靶点蛋白转化为对应的基因名。

二、疏肝益阳胶囊与ED 的交互靶点

在DrugBank[11]数 据 库（https://www.drugbank.ca）、GeneCards[12]数据库（https://www.genecards.org）、OMIM[13]数据库（https://www.omim.org）和TTD[14]数据库（https://db.idrblab.org/ttd）中进行ED 相关基因的查询，并汇总去掉重复基因。最后，将疏肝益阳胶囊靶点与ED 靶点一同导入Veney2.1 软件，绘制韦恩图，得到疏肝益阳胶囊与ED 的交互靶点。

三、“药物- 成分- 靶点” 网络构建

将交互靶点及其对应的化学成分文件导入Cytoscape 3.8 软件，绘制 “药物- 成分- 靶点” 网络图，并应用 “Analyze Network” 功能获得网络拓扑属性值。

四、蛋白互作网络（PPI）构建

利用String 数据库（https://string-db.org）对交互靶点进行蛋白互作分析，并把文件导入Cytoscape 3.8 中，绘制PPI 图。

五、生物过程分析

在WebGestalt 2019[15]平 台（http://www.webgestalt.org），对交互靶点进行GO 和KEGG 富集分析，其中GO 功能分析包括生物学过程（Biological Process，BP）、细胞成分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF），各自描述了基因产物可能行使的分子功能，所处的细胞环境以及参与的生物学过程。

结 果

一、疏肝益阳胶囊与ED 的交互靶点筛选

筛选出116 个药物口服生物利用度[16]（OB）≥30 和类药性[17]（DL）≥0.18 的疏肝益阳胶囊化学成分，再将这些化学成分所对应的靶点汇总去重，最终得到266个中药靶点。将各数据库中检索到的ED 疾病靶点汇总去重，得到1094 个靶点。最后，将疏肝益阳胶囊靶点同ED 靶点绘制韦恩图，获得83 个交互靶点，即为疏肝益阳胶囊治疗ED 的潜在作用靶点，见图1。

图1 疏肝益阳胶囊- 勃起功能障碍靶点韦恩图

二、“药物- 成分- 靶点” 网络构建

通过Cytoscape3.8 软件绘制疏肝益阳胶囊治疗ED 的 “药物- 成分- 靶点” 网络图，见图2。图中字体的大小、节点的大小和颜色的深度均与degree 值成正比关系，degree 值排名前10 的靶点，见表1； 再根据Gene Cards 数据库中的基因与勃起功能障碍疾病相关性（Relevance score）对表1 中的基因进行排序，推测雄激素受体（AR）、一氧化氮合酶2（NOS2）、一氧化氮合酶3（NOS3）等可能为疏肝益阳胶囊治疗ED 的重要作用靶点，见表2。根据degree 值大于10 的化学成分，可推测出quercetin、kaempferol 和beta-sitosterol 等化合物可能为疏肝益阳胶囊治疗ED 的主要化学成分，见表3。

表3 “药物- 成分- 靶点” 网络图中的主要化学成分

图2 疏肝益阳胶囊治疗ED 的 “药物- 成分- 靶点” 网络图

表1 “药物- 成分- 靶点” 网络图中的重要靶点

表2 疏肝益阳胶囊治疗ED 的重要靶点按相关性分数排序

三、PPI 网络构建

通过Cytoscape3.8 软件绘制交互靶点蛋白互作网络图，见图3。结果显示，白细胞介素6（IL-6）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、肿瘤坏死因子（TNF）和和胱天蛋白酶3（CASP3）等靶点蛋白基因degree 值较大，表明这些靶点与其他靶点相互作用较强，在网络中发挥重要作用。

图3 疏肝益阳胶囊治疗ED 的蛋白互作网络图

四、GO 和KEGG 富集分析

通过WebGestal 平台分析得到12 个最相关生物过程（Biological Process，BP）；19 个最相关细胞成分（Cellular Component，CC）；16 个分子功能（Molecular Function，MF）。其中BP 包含生物调节、对刺激的反应、代谢、多细胞生物、细胞通讯等生物过程；CC 包含膜、内膜系统、细胞外隙、核等细胞组分；MF 包含蛋白质结合、离子结合、分子转导活性等分子功能，见图4。

图4 GO 富集分析

通过WebGestal 平台进行KEGG 富集，选择加权集合覆盖（Weighted set cover）分析出7 条最相关信号通路，包括疟疾、糖尿病并发症中的晚期糖基化终产物及其受体（AGE-RAGE）、白细胞介素17（IL-17）、核因子κB（NF-κB）和血流剪切应力与动脉粥样硬化等信号通路，见图5。

图5 KEGG 富集分析

讨 论

古代医家对阳痿的认识和治疗，存在多种不同的学术观点。其中补肾法和从肝论治最具影响力，尤其是补肾法在历代中医治疗阳痿上取得了诸多成果[18]。但现代以来，王琦院士发现阳痿患者中青壮年并不少见，其年肾气本应旺盛，故临床用补肾法往往收效不显[19]，说明随着人们的生活压力和身体素质的变化，阳痿的病因病机同样也在变化。疏肝益阳胶囊是王琦院士基于“肝郁肾虚血瘀” 的病机所研制的，该药具有 “疏肝解郁，活血通络，补肾,兴阳振痿” 的作用。前期研究证实，疏肝益阳胶囊可改善性欲及射精功能，并提高抗疲劳能力。其机理与提高雄激素、促肾上腺皮质激素水平和缩小阴茎静脉管腔直径及减慢阴茎静脉回流速度有关[20]。

本研究通过网络药理学方法发现疏肝益阳胶囊治疗ED 的兴阳振痿、活血通络功能，其机制可能与AGE-RAGE、IL-17、NF-κB、血流剪切应力与动脉粥样硬化等信号通路相关。晚期糖基化终末产物（AGEs）通过蛋白质，脂质和核酸等非酶促糖基化和氧化作用产生，主要是由于衰老和某些病理状况（例如高血糖、肾功能衰竭症） 引起[21]。AGEs 作用于细胞表面的受体（RAGE）时，可刺激内皮细胞分泌白细胞介素（IL-8），并上调IL-8mRNA 的表达，IL-8 对炎症和免疫过程有重要的调节作用[22]。有研究表明，糖尿病状态下AGEs与RAGE 的结合效应可以引起大鼠阴茎海绵体组织中氧自由基的产生增多，抗氧化能力下降，从而加剧ED的发生发展[23]。IL-17 是一个重要的促炎症细胞因子，在多种炎性反应及自身免疫性疾病病理过程中发挥关键作用，IL-17 通过其相应的受体发出信号，激活包括NF-κB、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）等在内的下游信号通路[24]。NF-κB 是细胞内重要的转录调节因子，NF-κB信号通路在复杂的炎症细胞因子网络中起着中心调节的作用，不仅参与机体免疫、炎症、代谢、遗传等过程，还在细胞增殖、分化及凋亡的发生发展中也扮演着重要角色[25]。血流剪切应力是指血流施加在血管壁内皮表面的摩擦力，其与血液特性、血流速度和血管形态有密切关系。剪切应力对血管内皮细胞形态、结构、功能的调节起主要作用[26]。Burnett[27]等研究表明阴茎脉管中血流诱导的流体剪切力能够激活NOS3 大量合成内皮来源的一氧化氮（NO），进而维持完全勃起。由 “药物- 成分- 靶点” 网络图可见疏肝益阳胶囊治疗ED 具有多成分、多靶点的特点，相对于单分子靶点药物来说，疏肝益阳胶囊可同时调节疾病网络系统中的多个环节。通过本次研究，为疏肝益阳胶囊在 “肝郁、肾虚兼血瘀证”所致阳痿和轻度动脉供血不足性阳痿的应用进一步提供了理论支持。但由于目前研究手段的局限性无法考虑到药物在体内的代谢过程等因素，因此本研究结果还有待进一步的研究验证。