庄 彪 闵志均 倪 熊 王廷峰 吴德俊 崔 鹏

结肠直肠癌(carcinoma of colon and rectum，CRC)是世界上第三大常见的癌症与第四大死亡原因的胃肠道恶性肿瘤，其具有高复发率和高致死率的特点[1～5]。研究表明不良饮食习惯、肠道炎症、肠息肉、遗传、年龄等增加患癌风险，并且年轻患者侵袭更强[6,7]。如何探索结直肠癌新的作用机制开发新的疗法成为研究的新方向。长链非编码 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一种超过200个核苷酸且不翻译成蛋白质的转录本，且被认为没有生物学功能的转录“噪声”[8,9]。研究表明，在肿瘤中其参与增殖、凋亡、迁移、侵袭、转移等过程[10,11]。本研究通过生物信息学筛选发现lncRNA-AK126393与结直肠癌自噬相关，并在结直肠癌细胞中进行表达鉴定，进一步干预其表达探讨其在结直肠癌中的作用机制。

材料与方法

1.实验材料：MonAmpTMSYBR®Green qPCR Mix(MQ10301S，苏州莫纳生物科)；PrimeScript RT Master Mix (RR036A，日本TaKaRa公司)；RNAiso Plus(9109，日本TaKaRa公司)；Annexin V-FITC/PI apoptosis kit(70-AT101-100，杭州联科生物技术股份有限公司)；Cell cycle staining kit(70-CCS012，杭州联科生物技术股份有限公司)；Lipofectamine TM 2000(11668030，美国Invitrogen公司)；Fetal Bovine Serum(10099141，美国Gibco公司)；RPMI1640培养基(31870082，美国Gibco公司)；Bcl2(cst- 3498)、Bax(cst- 2774)、PI3K(cst- 4249)、P-PI3K(cst- 13857)、Akt(cst- 9272)、P-Akt(cst- 4060)、LC3(cst- 12741)和GAPDH(cst-5174)购自美国Cell Signaling Technology公司；质粒构建、引物合成、二抗等常用生化试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司；人结直肠癌细胞系HCT-116、SW480、SW620和正常人结肠组织细胞CCD-18CO购自上海富衡生物科技有限公司;枪头、细胞培养板等常用耗材购自无锡耐思生命科技股份有限公司。

2.实验方法：(1)细胞培养和转染：人结肠癌细胞系和正常人结肠组织细胞培养均用10%FBS+1%双抗的RPMI164完全培养基进行培养，静置于37℃的恒温培养箱中进行培养，当细胞密度超过80%后进行消化传代接种，按105个/孔的密度将细胞接种与6孔板中，细胞转染按照Lipofectamine TM 2000转染试剂说明书进行操作。AK126393片段全长合成并构建真核表达质粒委托工生物工程(上海)股份有限公司完成，使用Lipofectamine TM 2000将pcDNA3.1-AK126393质粒和pcDNA3.1空载体分别转染进入细胞，转染6h后更换正常完全培养基培养。(2)qRT-PCR：经过转染处理后细胞，根据RNAiso Plus说产品说明书提取总RNA，并应用RT Master Mix适合对总RNA进行反转录，使用SYBR Green qPCR Mix进行qRT-PCR扩增。扩增条件为：95℃ 5min、95℃ 10s、60℃ 30s的40个扩增循环的热循环参数进行qPCR，靶基因引物序列如下：AK126393-上游引物：5′-TAAAGCTCCCGATGCCAGAC-3′，AK126393-下游引物：5′-GCCAACCTGATGTCCTTGGA-3′；GAPDH-上游引物：5′-GAGGCTGGGAACCTTAAGGT-3′，GAPDH-下游引物:5′-AGGGCCGCTGGTCAGAA-GTT-3′。靶基因的表达水平用△Ct归一化，相对倍数变化用2-△△Ct。(3)CCK-8检测：各组细胞以104个/孔接种于96孔细胞培养板中，在接种后继续培养24、48、72和96h后进行增值检测。每孔加入10μl CCK-8溶液继续培养1h，用酶标仪测定样本在450nm出的吸光度。(4)流式细胞术：将各组细胞用胰酶消化并收集各组细胞，根据Annexin V-FITC/PI apoptosis kit和Cell cycle staining kit试剂盒厂商说明书进行细胞染色处理后用Cytoflex流式细胞仪检测个组细胞凋亡和周期变化。(5)Western blot法：将培养板中的各组细胞加入蛋白裂解液及PMSF进行提取细胞总蛋白，并用BCA试剂盒检测蛋白浓度。取20μl蛋白样品加载到10%的分离胶上，并通过电泳分离蛋白质。然后将分离后的蛋白质转移到PVDF膜上，加入封闭液37℃封闭1h；将膜与LC3、Bax、Bcl2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GAPDH抗体4℃过夜孵育。TBST反复洗膜3次后，将膜与辣根过氧化物标记的二抗孵育，室温轻摇1h，洗膜后，入显色液显色并拍摄分析。

结 果

1.lncRNA AK126393在正常人结肠组织细胞和结直肠癌细胞系的表达：与正常人结肠组织细胞系(CCD-18CO)比较，lncRNA AK126393在结直肠癌细胞系(HCT116、SW620、SW480)中异常低表达(P<0.05)，其中SW480细胞中表达量最低(P=0.000，图1)。

图1 AK126393在正常人结肠组织细胞和结直肠癌细胞系的表达与CCD-18CO细胞比较，*P<0.05，** P<0.01，***P=0.000

2.在SW480细胞中AK126393过表达质粒的转染效率：在转染阴性质粒空载体和AK126393过表达质粒后SW480细胞中的AK126393的相对表达量为1.05±0.05和2.56±0.21(P<0.01，图2)。

图2 AK126393在SW480细胞中的相对表达水平与NC组细胞比较，*P<0.01

3.过表达AK12639对SW480细胞增殖的影响：CCK8检测结果显示， AK126393过表达组细胞活力出现显著下降(P<0.05，图3A)，在流式周期检测试验中，观察到一致的数据(图3B)。

图3 AK126393过表达抑制SW480细胞增殖A.转染0、24、48、72、96h后，通过CCK8测定法测定SW480细胞的细胞活力；B.转染24h后，通过流式细胞周期法测量SW480细胞的细胞周期。与NC组比较，*P<0.05，**P<0.01

4.AK126393过表达对人结肠癌细胞凋亡和自噬的影响：流式细胞术检测结果显示，AK126393过表达组细胞凋亡比例显著增加(图4A)；Western blot法检测结果显示凋亡蛋白Bax表达增高，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，同时发现自噬蛋白LC3-Ⅰ降低，LC3-Ⅱ增高(图4B)。

图4 AK126393过表达对SW480细胞凋亡和自噬的影响A.流式细胞仪测定细胞凋亡；B.Western blot法检测Bcl-2、Bax和LC3蛋白表达。与NC组细胞比较，*P<0.05，**P<0.01

5.AK126393过表达抑制PI3K/Akt信号通路：Western blot法检测结果如图5显示，与NC组相比较，AK126393过表达组细胞中PI3K和Akt的磷酸化水平显著降低，而总PI3K和总Akt的表达无变化。

图5 AK126393过表达对SW480细胞中PI3K/Akt通路的作用与NC组细胞比较，*P<0.05

讨 论

研究表明，lncRNA的表达异常影响细胞稳态的的各个方面，如生存，增殖、迁移和基因组稳定性等，并且多种lncRNA的表达异表达与肿瘤的恶性转化和预后不良有关[12～14]。随着二代测序技术的发展与进步，越来越多的lncRNA的异常表达与不同类型的癌症有关得到证实[15]。AK126393是高通量筛发现的一种新型的与癌症相关的lncRNA，位于染色体10q26，在结肠癌组织中异常低表达，被认为是具有抑制肿瘤作用的分子[16]，而其用机制不清楚。因此，笔者在细胞系中检测了AK126393表达，结果与先前的文献分析相符。为了进一步证实，笔者通过过表达SW480细胞，结肠癌细胞增值收到抑制、凋亡增加并发生了自噬现象。lncRNA在肿瘤细胞中的调控作用复杂，通常与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和自噬等生物学行为有关。例如，lncRNA TUG1调控miRNA-145促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，lncRNA HULC促进肺癌细胞增殖与提高肺癌细胞自噬水平,且与自噬相关蛋白ATG7相关[17,18]。

PI3K/Akt广泛分布在细胞中，许多反定义RNA影响细胞表型的调控都是通过PI3K/Akt途径实现的，如调节细胞增、分化、凋亡和代行等[19～21]。本研究中笔者提出AK126393抑制PI3K/Akt新思路，为明确AK126393在结肠癌细胞系调控的作用提供了支持。PI3K是具有催化活性的胞内磷脂酰肌醇激酶，在多种人类癌症中通常由于基因扩增和体细胞点突变而失调[22]。Akt是PI3K下游的靶向调节分子，在维持细胞活和凋亡中起到重要功能蛋白，因为它激活多种酶和转录因子来调节细胞功能[23]。研究表明，在肿瘤增殖、凋亡、侵袭、耐药的方面p-Akt蛋白起着重要的作用，是重要促进因子[24,25];在抗癌药物研发方向Akt的活化抑制是重要研究途径之一[26]。本研究发现，上调AK126393在SW480细胞中表达能抑制其增殖、促进其凋亡并引起细胞自噬；并且发现其PI3K和Akt的磷酸蛋白化水平显著降低，PI3K和Akt总蛋白无明显变化。从而证明AK126393可以通过PI3K/Akt通路的激活抑制来实现抗癌作用。

本研究发现，在结直肠癌细胞中lncRNA AK126393具有抑制细胞增殖、促进凋亡以及引起细胞自噬的作用。此外证实，lncRNA AK126393通过抑制PI3K/Akt途径激活来实现诱导结肠癌细胞凋亡。因此，lncRNA AK126393为今后结肠癌的诊治提供新的潜在靶标。