徐 琦 朱张茜 刘泽政 朱建碧 丁欢欢 郑 洁

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性炎症性关节疾病，病因不明，发病机制复杂[1]。RA的特征是进行性和不可逆的炎症性关节损伤，导致关节、软骨、骨骼进行性破坏，从而严重影响关节结构与关节功能，降低患者的生活质量[2，3]。改善病情药物(disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs)是指有效预防或减少关节损伤的药物[4]。但全身炎症控制的同时，局部持续的滑膜炎症是造成疾病复发与靶关节破坏的关键因素，因此寻找一种有效的滑膜炎微创治疗手段是当前的一大难题[5]。经皮关节腔内甲氨蝶呤-透明质酸偶合物(methotrexate-hyaluronic acid coupling，MTX-HA)注射是一种新兴的有潜力的治疗关节滑膜炎的方法[7，8]。另外在先前的研究中超声引导下经皮滑膜射频消融术(radiofrequency ablation, RFA)被证明是一种值得尝试的关节滑膜炎微创疗法[9]。上述两种治疗方式的治疗效果比较尚无报道，值得进行对比研究。本研究采用AIA兔膝关节滑膜炎动物模型模拟RA的病理生理过程，对比超声引导下经皮关节腔MTX-HA注射与超声引导下经皮RFA术的疗效，初步探讨两种疗法的临床应用前景。

材料与方法

1.实验动物与分组：本项研究在温州医科大学动物实验中心进行，纳入40只6月龄雄性清洁级日本大耳白兔，体质量为2.0～3.0kg，共分为3组：AIA组30只，以AIA动物模型法进行造模[10]。AIA动物模型的建立与造模成功评价标准与之前的研究一致[9]。选择其中15只进行左侧膝关节RFA治疗，作为RFA组；另外15只进行左侧膝关节MTX-HA关节腔注射治疗，作为MTX-HA组。其余10只兔左侧膝关节0.9%氯化钠注射液局部注射，作为对照组。

2.试剂与器具：卵清白蛋白(OVA，美国Sigma公司)，弗氏完全佐剂(美国Sigma公司 F5881-10ml)。使用意大利Braco公司生产的声诺维(Sonovue)为超声造影剂，按照使用说明化为乳白色溶液后，1次0.1ml经耳缘静脉注射，再注射1ml 0.9%氯化钠注射液。使用美国Covidien公司生产的射频消融仪进行RFA治疗，射频消融针型号为Cool-tip ACT1510，电极长度15cm，裸露长度1cm，进行RFA时采取60W等额输出功率。

3.超声仪器与参数：采用GE LOGIQ E9型超声诊断仪，使用ML6-15线阵探头进行灰阶和能量多普勒超声检查，探头频率7.0MHz，PWr -15dB，机械指数0.35，使用配备超声造影软件的9L线阵探头进行超声造影检查，频率GEN 7.0MHz，PWr -15dB，机械指数0.35，输出能量10%。造影前调节增益至适当水平。

4.滑膜射频消融术操作过程：2%戊巴比妥钠1.5ml/kg兔耳缘静脉麻醉，剃毛、消毒后进行滑膜超声造影，观察滑膜增强情况。局部注射0.9%氯化钠注射液作为液体隔离带，保护关节组织[11]。多点连续消融法逐步消融滑膜组织[12]。完成后即刻第2次超声造影，观察有无残留活性的滑膜组织及是否存在周围软组织的误消融区，如有残存活性滑膜区域，重复射频消融至消融完全。

5.MTX-HA制备与注射：HA溶液具有通过混合容易地掺入各种生物试剂的特性，因此通过将HA溶液与MTX混合后可得到MTX-HA溶液，制备为用于局部注射治疗的制剂[5]。获得的MTX-HA为半透明带红色的黏稠乳液，可在室温下流动。以0.5ml MTX-HA(5mg HA当量，300nmol MTX当量)每周1次在超声引导下进行关节内给药，注射至滑膜增生明显的区域，2周注射完毕后开始术后观察。

6.术后处理与评价：RFA组术后消融处冰敷2h，RFA组与MTX-HA组术后3天予16万单位/毫升青霉素2.5ml肌内注射预防感染。手术当天及术后第2、4周进行评价，4周后处死白兔。术后评价内容包含：测量关节周径、超声评价关节积液、滑膜最大厚度、滑膜炎评分，按3分法进行超声滑膜炎半定量评分[13]。在AIA模型造模成功后，实验组内两位不同观察者独立对随机抽取的15只AIA模型兔膝关节滑膜炎进行半定量评分，以确定不同观察者间的评分是否具备良好的一致性。髌旁内外并横断韧带联合切口解剖膝关节，肉眼观察双膝关节滑膜、软组织损伤粘连、软骨与骨侵蚀情况。根据膝关节大体解剖所见将两侧膝关节软骨、骨侵蚀进行半定量评价；即软骨形态正常为0分，软骨轻微侵蚀并<50%所见面积为1分，软骨显著侵蚀并≥50%所见面积为2分；关节面骨皮质光滑、无骨侵蚀为0分，关节面骨皮质轻微侵蚀为1分，关节面骨皮质显著侵蚀为2分。组织学评价：切取膝关节带有肌肉、滑膜组织、软骨下骨组织块，石蜡包埋，5μm连续切片，HE染色后镜下观察。

结 果

40只大耳白兔体质量为2.11～3.05kg，平均体质量为2.56±0.27kg，单因素方差分析结果显示，实验开始时3组间体质量比较，差异无统计学意义(F=2.494，P>0.05)；而在饲养至手术后第4周处死前，3组白兔体质量比较，差异有统计学意义(F=11.65，P<0.01)，组间两两比较显示，RFA组、MTX-HA组体质量均低于对照组，差异均有统计学意义(P均<0.05，图1)。两位不同观察者独立在对随机抽取的15只AIA模型兔膝关节进行超声滑膜炎评分的Bland-Altman散点图，观察者间评分的算数平均值-0.067，95%置信区间(95% CI)为-0.46～0.32，结果显示不同观察者间的超声半定量评分重复性良好(图2)。

图1 40只大耳白兔3组间体质量比较A.实验开始时体质量对比;B.手术后第4周处死前体质量比较。*P<0.05，**P<0.01

图2 两位观察者对15只大耳白兔膝关节滑膜炎超声半定量评分的Bland-Altman散点图

30只兔AIA模型造模均成功；RFA组与MTX-HA组手术经过顺利(图3)，术中与术后观察期内无动物死亡现象，均顺利观察至术后第4周。13只RFA组白兔第1次消融后超声造影评价提示消融，另外2只RFA组兔1次消融后超声造影发现尚存在未灭活的滑膜组织，进行2次消融后提示滑膜灭活完全。MTX-HA组15只白兔顺利完成连续2周、每周1次关节腔内注射MTX-HA液，注射时全程超声引导将MTX-HA液注射至关节腔滑膜增厚最明显处。

图3 RFA组与MTX-HA组兔膝关节术中超声图A、B、C分别为RFA组超声测定滑膜厚度、滑膜炎及RFA术中；D.RFA组术前CEUS滑膜组织高增强；E.RFA组术后CEUS滑膜组织无增强； F、G、H.MTX-HA组超声测定滑膜厚度、滑膜炎及关节腔药物注射术中

手术当天术前及术后2、4周常规评价结果显示详见图4。与术前比较RFA组关节周径在术后2周无显著变化(P>0.05)，术后4周时则出现显著减小(P<0.01)；而MTX-HA组则是在术后2周开始出现关节周径减小(P<0.01)；组间比较术后4周时RFA组、MTX-HA组与对照组比较关节径差异均有统计学意义(P<0.01)。RFA组、MTX-HA组超声评价关节积液、滑膜厚度在术后2、4周时与术前比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，即两组积液在术后稳步减少，滑膜厚度逐渐变薄；组间比较表明RFA组滑膜厚度减小对比MTX-HA组更明显(P<0.05)。超声半定量评价滑膜炎结果表明RFA组在术后即下降至低值，并在4周时无显著滑膜炎复发；而MTX-HA组与术前对比，术后滑膜炎评分在4周时才出现显著的评分降低(P<0.01)，并且在术后2周、4周时滑膜炎评分均高于RFA组(P均<0.05)。

图4 术前与术后2、4周评价指标组间对比图A.积液厚度随时间变化;B.滑膜厚度随时间变化;C.滑膜炎评分随时间变化；D.关节周径随时间变化。天数0代表手术当天，*P<0.05，**P<0.01

术后4周大体解剖关节软骨、骨侵蚀半定量评分比较如图5、图6所示，RFA组与MTX-HA组左侧膝关节(手术侧)软骨、骨评分均低于右侧，但仅RFA组两侧比较差异有统计学意义(P<0.01)，而MTX-HA组两侧比较差异无统计学意义(P>0.05)。病理组织学显示(图7)，RFA组观察到了坏死的滑膜组织细胞，但周边肌肉组织并无显著的组织破坏与组织坏死情况，两者分界清晰。MTX-HA组观察到了小片状滑膜组织细胞，并具备完整的细胞形态，表明仍存在一定的组织活性。

图5 兔膝关节解剖后直视下半定量骨、软骨评分A.软骨侵蚀半定量评分;B.骨侵蚀半定量评分。*P<0.01

图6 RFA组与MTX-HA组兔两侧膝关节面大体解剖所见A、C分别显示RFA组与MTX-HA组术侧软骨、骨侵蚀较轻；B、D分别显示RFA组与MTX-HA组对侧明显软骨、骨侵蚀

图7 RFA组与MTX-HA组兔关节横纹肌与滑膜病理图A.RFA组(HE,×10);B.MTX-HA组(HE，×20)

讨 论

有效治疗与控制关节滑膜炎是各种骨关节病关键问题，特别是在以滑膜炎为关键病理生理过程的类风湿性关节炎中该问题更加关键[1～3]。很多研究结果显示，当滑膜炎被有效控制后，骨关节病的预后出现明显好转[3～5]。寻求一种有潜力的滑膜炎微创治疗方式是解决该问题的有效途径。

甲氨蝶呤(MTX)是最常用于治疗RA的DMARDs之一[4]。但系统性毒性、口腔炎、恶心、骨髓抑制和肝毒性限制了MTX的口服给药[14，15]。MTX关节腔内局部注射给药是靶向治疗手段之一，可以有效减少全身不良反应[7]。但单纯的关节腔内注射MTX被证实疗效不佳，与目标区域药物浓度迅速降低有关[16]。因此有研究者研究应用MTX与透明质酸(hyaluronic，HA)偶合物局部关节腔内注射，从而减缓MTX释放，使关节滑膜炎症减轻[7，8]。在笔者前期的研究中，超声引导下膝关节滑膜射频消融术被用于治疗与清除AIA兔膝关节滑膜炎，并取得了较好的疗效，并使炎性细胞因子TNFα、VEGF的表达得到了抑制，因此也是一种微创治疗局部滑膜炎的手段之一[9]。两种当前有前景的关节滑膜炎微创治疗方式有必要进行疗效的对比研究，剖析其中优劣。

本研究采用的AIA动物模型成模稳定，RFA组、MTX-HA组手术经过均顺利，治疗前后无动物死亡现象[10]。术后动态观察膝关节肿胀结果显示RFA组、MTX-HA组膝关节周径均比术前减小，差异在于RFA组关节肿胀在术后2周内并未显著好转，在术后4周时显著好转，与RFA术热沉积造成软组织重症有关，与其他部位的RFA术基本一致[11，12]。而MTX-HA组术后关节肿胀则呈现随时间延长逐步好转的现象，术后4周两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。此外，在使用超声观察评价关节积液、滑膜厚度时RFA组、MTX-HA组也出现了积液在术后稳步减少、滑膜厚度逐渐变薄的现象，从影像学角度证实了两组的疗效。值得注意的是，RFA组滑膜厚度减小更明显，且滑膜炎半定量评分降低也更显著(与MTX-HA组比较，P均<0.01)，可以认为在滑膜组织灭活方面，RFA组治疗效果优于MTX-HA组。其原因可能为RFA术直接灭活滑膜组织的同时抑制了炎性细胞因子如TNF-α、VEGF的表达；而MTX-HA局部注射虽然可以控制滑膜炎症，减少炎性细胞因子的释放，但不能完全灭活滑膜组织，在病因持续的情况下造成滑膜炎症复发，因此不难解释该现象产生的原因。

术后4周时动物关节解剖结果显示(图6)，RFA组与MTX-HA组手术侧软骨、骨评分低于对侧，但MTX-HA组比较差异无统计学意义，而RFA组比较差异有统计学意义(P<0.01)，且病理组织学也印证了这一点，这表明RFA术在完全灭活了滑膜组织后中期关节软骨、骨侵蚀预后要优于MTX-HA关节腔注射治疗。

RFA术在治疗肿瘤时可以诱导抗肿瘤免疫效应，活化T细胞并使之浸润在肿瘤中，调节并增强机体免疫反应，最终起到抗肿瘤作用[17，18]。而RFA术在治疗自身免疫性关节病(如RA)时似乎在灭活滑膜组织细胞的同时，调节了关节内细胞炎性细胞因子的表达，抑制局部关节滑膜炎的复发，使关节软骨、骨侵蚀进展减缓[9]。制备MTX与HA偶合物方便快捷，可较容易制备获得，并且可以长时间保持局部药物治疗浓度，因此可有效抑制关节炎性细胞因子的产生[19]。通过本研究也进一步证实了其具备较好的抑制关节滑膜炎症的治疗效果。

超声引导下滑膜RFA术与MTX-HA关节腔内注射术比较，两者均能明显抑制局部关节滑膜炎症，使局部关节症状好转，阻止关节软骨、骨侵蚀进展；在作用机制方面RFA术与MTX-HA关节腔内注射术均能调节与抑制关节炎性细胞因子表达与释放，两者的差异主要在于RFA术有望彻底灭活滑膜组织，在抑制滑膜炎复发方面优于MTX-HA关节腔内注射术。两者在操作方面均较简便，MTX-HA注射更易于掌握，并且MTX-HA治疗后恢复期较RFA术更快，不容易造成关节肿胀等特点。因此两者治疗方式各有优势，值得在临床中进一步推广应用。但本研究也存在一定的局限性，首先AIA动物模型虽然较精准地模拟了RA的病理生理过程，但与实际RA尚存在一定差异，另外关节解剖半定量评分对于观察者来说也存在一定差异。