周莎莎，于之清，童 武，郑 浩，李国新，徐晶晶，程雪飞，陈 静，童光志

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）是α-疱疹病毒亚科，水痘疱疹病毒属的成员。PRV可感染不同年龄段的猪，主要引起种猪繁殖障碍、育肥猪生长迟缓、哺乳仔猪死亡。自2011年末以来，国内许多Bartha-K61免疫猪场频繁暴发伪狂犬病（pseudorabies, PR），给养猪业造成了巨大经济损失。已有研究表明，引起国内免疫猪场暴发PR的是一种PRV变异毒株[1-5]，相比经典PRV，变异PRV表现出更强的毒力和致病力[6]。叶超等[7]在全基因组水平对PRV流行株进行遗传演化分析，结果表明，我国当前流行株与国外流行株存在较大差异，国外流行株属于基因Ⅰ型，而国内流行株属于基因Ⅱ型。

PRV为囊膜包被的DNA病毒，其囊膜中包含11种糖蛋白，糖蛋白B（gB）、糖蛋白C（gC）和糖蛋白D（gD）作为重要的保护性抗原可以诱导机体产生保护性免疫反应，在激活细胞免疫和中和抗体产生中发挥重要作用[8-15]。序列分析发现，与疫苗毒株Bartha-K61相比，当前流行变异株JS-2012的主要保护性抗原gB、gC和gD的氨基酸序列发生了不同程度的变异[16]，这可能与疫苗Bartha-K61针对PRV变异株不完全保护现象相关。本研究以PRV疫苗株Bartha-K61和PRV变异株JS-2012-ΔgE/gI为骨架，使用CRISPR/Cas9技术结合同源定向修复（homology directed repair，HDR），分别构建两株骨架病毒gB、gC和gD基因替换的重组PRV，通过小鼠交叉免疫保护试验探究骨架病毒与其重组病毒间的免疫原性差异。本研究为揭示经典疫苗株Bartha-K61针对PRV变异株不完全保护现象的原因提供了理论基础。

1 材料和方法

1.1 细胞、病毒和质粒猪肾细胞（PK-15细胞）和非洲绿猴肾细胞（vero细胞）由本实验室保存；……