牛伟杰，于学祥，高 宇，库旭钢，何启盖,3*，罗 锐*

(1.华中农业大学 动物医学学院，湖北 武汉 430070；2.华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070；3.华中农业大学 动物疫病诊断中心，湖北 武汉 430070)

非洲猪瘟(ASF)是一种烈性传染病，可引起感染猪较高的死亡率，对世界各国养猪业造成了巨大的经济损失。而自2018年ASF传入我国以来，目前流行形式依然严峻。非洲猪瘟病毒(ASFV)感染可引起患病猪体表及内脏广泛的出血和水肿，并可导致100%的死亡率[1]。经典猪瘟(CSF)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)同样是目前严重损害我国及世界生猪养殖产业的常见传染性病毒病。CSF在猪群中扩散后发病率高达 80%～100%，皮肤出血、高烧，厌食，胃肠道症状，全身无力和结膜炎等均是CSF感染的表现。PRRS可导致发病猪的耳朵及其他部位皮肤发绀，因此得名“猪蓝耳病”[2]。我国《国家中长期动物疫病控制规划(2012—2020年)》要求到2020年优先对种猪场实行CSF、PRRS的净化，并逐步推行至对全国范围的猪场。

在不同规模化养猪场中，ASF、CSF、PRRS等疾病不仅严重影响经济效益，且感染猪临床症状的高度相似性，使得养殖技术人员难以通过病猪表现进行鉴别[2-3]。而多重检测方法，高效的鉴别诊断则提供了有力支持，同时简化操作步骤、降低实验污染风险、节约样品、试剂成本以及试验时间，可为临床疾病检测提供更高效的服务[4]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞、病毒和疫苗毒株 猪瘟病毒疫苗毒株(HCLV)及疫苗稀释液购于武汉科前生物股份有限公司；猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)以及Marc-145细胞(非洲绿猴胚胎肾细胞)均由本实验室保存；E.coli5α感受态细胞购于北京全式金生物技术有限公司。

1.1.2主要实验仪器及试剂 病毒(DNA/RNA)核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪购自(西安)天隆科技有限公司；RNA反转录试剂盒、BIOWEST琼脂糖、2×Es Taq MasterMix、DL2000 DNA Marker、DMSO、和2×Probe MasterMix购自大连宝生物技术有限公司(TaKaRa)；GoldenView核酸染料购自北京艾德莱生物科技有限公司；DEPC水以及50×TAE电泳缓冲液购于生工生物工程(上海)股份有限公司；TSA培养基购自美国BD公司。

1.1.3样品来源 本研究共收集了839份全血(EDTA抗凝血)样品，为2019年2月至2020年1月来自湖北省、湖南省和江西省，为保育和育肥阶段有皮肤发绀、体温升高等症状猪只的14家规模化猪场。

1.2 方法

1.2.1引物和探针的设计 本研究在设计引物及探针时参考CSFV、PRRSV流行的所有亚型，使用Primer5.0软件分别对CSFV 保守区域5′UTR基因、PRRSV保守区域ORF6基因设计多对引物和探针以供筛选。ASFV引物及探针序列参考OIE《陆生动物诊断实验及疫苗手册2019》推荐序列。ASFV(F:5′-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3′,R:5′-GATACCACAAGATCAGGCCGT-3′,Pro-be:5′-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGTAMRA-3′);CSFV(F:5′-AACGGAGGGACTAGCCATAG-3′,R:5′-GTGCTCAC-GTCG-AACTACTGA-3′,Probe:5′-ROX-CCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTA-BHQ2-3′);PRRSV:(5′-ATCACCTCCAGATGCCGTTT-3′,R:5′-CG-ACAAATGCGTGGTTATCA-3′,Probe:5′-CY5-TACATTCTGGCCCCTGCCCACCAC-BHQ3-3′)。引物和探针均由武汉擎科生物有限公司合成，于-20℃冰箱保存备用。

1.2.2阳性质粒的制备 使用本研究所设计的标准质粒引物，以CSFV、PRRSV的cDNA为模版，按照以下反应体系(表4)和反应条件进行PCR扩增(ASFV B646L标准质粒前期由本实验室送生物公司合成)。CSFV-5′UTR(F：5′-GTATACGAGGTTAGCTCATTCTCG-3′,R:5′-GTGCCATGTAC-AGCAGAGATTTTTTA-3′)；PRRSV-ORF6(F:5′-CTTTTGGCGTTTTCCATTACC-3′,R:5′-CA-ACACGAGGCTTTTCAACC-3′)。扩增标准质粒PCR反应条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，40个循环；72℃ 终延伸10 min，产物4℃短暂保存。

将产物胶回收纯化，链接 pMD18-T 载体后转化感受态细胞大肠杆菌DH5α。经培养后挑取阳性菌落进行PCR鉴定并测序，将阳性质粒测定浓度并计算拷贝数，进行倍比稀释后-20℃保存。

1.2.3多重qPCR反应条件优化 在多重实时荧光定量 PCR 反应的条件下，使用DEPC H2O将引物及探针浓度分别稀释为4，6，8，10，12，14，16，18 μmol/L，在体系中加入1 μL的引物以及探针，使其终浓度分别为0.16，0.24，0.32，0.40，0.48，0.56，0.64 μmol/L，摸索最佳浓度；退火温度采用 58,59,60,61，62℃，循环数采用40次；反应总体系采用25 μL。

1.2.4标准曲线建立 分别选取标准模板浓度梯度分别为103～107copies/μL的ASFV、CSFV、PRRSV标准模板为阳性模板，以去离子水为阴性对照模板，进行多重qPCR体系扩增。分别将结果分析绘制扩增曲线，使用Microsoft Office Excel 2013软件绘制标准曲线。

1.2.5特异性试验 用建立的多重qPCR方法分别检测PEDV、TGEV、PCV2、PRV、PPV和JEV，验证所建立的多重实时荧光定量PCR方法的特异性。

1.2.6敏感性试验 选取浓度梯度为 100～108copies/μL 的标准质粒模板，使用DEPC H2O做10倍倍比稀释后反转录获得cDNA，作为阳性模板，以去离子水为阴性对照模板，进行扩增，探究其检测下限。

1.2.7重复性试验 选取标准模板浓度梯度为 104～106copies/μL 的标准模板为阳性模板，以双蒸水为阴性对照模板，进行同一批次和不同批次的多重实时荧光定量 PCR 扩增，计算组内和组间变异系数。

1.2.8方法对比 本研究收集了自2019年12月至2020年1月来自湖北省6个规模化猪场的180份样品(组织样2份、口腔液34份、全血144份)，分别使用OIE推荐的ASFV qPCR检测方法和CSFV RT-qPCR、PRRSV-qPCR国标检测方法与本研究建立的多重RT-qPCR进行比较。

1.3 ASFV、CSFV和PRRSV的病原学调查应用所建立的多重qPCR方法检测 2019年12月至2020年1月份送检的 839 份保育和育肥阶段猪只的抗凝血样品，调查ASFV、CSFV、PRRSV 3种病原的流行情况和特点,并使用卡方检验进行显著性分析。

2 结果

2.1 重组质粒的制备将过夜培养的菌液提取质粒作为模版，使用标准质粒引物进行常规 PCR 检测，结果均为预期大小目的片段，PRRSV-ORF6：414 bp，CSFV-5′UTR：373 bp(图1)，其中ASFV-B602L质粒由本实验室保存(1.39×1010copies/μL)。经测序均与目的基因相符。所构建的CSFV质粒的浓度为1.65×1010copies/μL，PRRSV质粒的浓度为2.62×1010copies/μL。

左.PRRSV-ORF6；右.CSFV-5′UTR。M.DL2000 DNA Marker;1.PCR 产物；2.阴性对照图1 质粒PCR产物电泳图

2.2 反应条件的优化通过对引物和探针浓度及退火温度进行优化，选择荧光强度高，Ct值较小、扩增效率接近100%，非特异性信号未出现时最大循环数的条件。在调整其他影响因素的过程中，不同退火温度差异较小，最终选择为60℃。ASFV、CSFV、PRRSV引物的最佳浓度均为0.48 μmol/L，探针浓度均为0.40 μmol/L，结果见图2～4。

2.3 标准曲线建立以优化的反应条件(体系25 μL:Mix 12.5 μL、引物和探针各1 μL(浓度分别为0.48和0.40 μmol/L)、质粒1 μL、H2O 5.5 μL，温度：60℃)。标准模板的扩增曲线及相应的标准曲线见图5～7。在 101～108copies/μL 的梯度浓度区间内，显示良好的线性关系，所得拷贝数(x)与Ct 值(y)的线性方程以及相关系数R2为：

ASFV:y=-3.558x+38.88，R2=0.998；

CSFV:y=-3.155x+39.55，R2=0.992；

PRRSV:y=-3.143x+38.23，R2=0.999。

左.ASFV引物;右.ASFV探针图2 ASFV引物/探针浓度优化

左.CSFV引物;右.CSFV探针图3 CSFV引物浓度优化

左.PRRSV引物;右.PRRSV探针图4 PRRSV引物浓度优化

左.扩增曲线；右.标准曲线图5 ASFV扩增曲线及标准曲线

左.扩增曲线；右.标准曲线图6 CSFV扩增曲线及标准曲线

左.扩增曲线；右.标准曲线图7 PRRSV扩增曲线及标准曲线

2.4 特异性试验分别以 PEDV、JEV、TGEV、PRRSV、CSFV、PPV、PCV2 和 PRV 的核酸为反应模板，用所建方法扩增，结果表明只有阳性模板有荧光信号(图8)，说明所建方法特异性良好。

1.ASFV；2.CSFV；3.PRRSV；4～11.分别为PCV2、PCV3、PRV、JEV、FMDV、PED、TGE、PDCoV；12.阴性对照图8 特异性试验

2.5 敏感性试验选取标准模板浓度梯度为100～108copies/μL的标准模板进行多重实时荧光定量 PCR 扩增扩增，结果显示，多重qPCR方法检测ASFV、CSFV、PRRSV的拷贝数最低分别为 13，16,26个拷贝,说明所建方法灵敏性高(图9～11)。

图9 ASFV灵敏性实验

图10 CSFV灵敏性试验

图11 PRRSV灵敏性试验

2.6 重复性试验选取104～106copies/μL 的标准模板进行组内、组间重复试验,结果见表8。结果表明变异系数均在2%以下，说明所建立的多重实时荧光定量PCR方法在重复性方面表现优秀。

表8 重复性试验结果

2.7 方法对比OIE ASFV qPCR与所建方法均未检出ASFV阳性核酸。

国标CSFV RT-qPCR检出核酸阳性37份，阴性143份；所建方法检出CSFV阳性核酸35份，阴性145份。其中35份阳性样品、143份阴性样品结果一致，共2份样品检测结果不一致。敏感性性为94.59%(35/37)，特异性为100.00%(143/143)，总符合率为98.89%。

PRRSV多重RT-qPCR检出阳性核酸41份，阴性139份；所建方法检出PRRSV阳性核酸40份，阴性140份。其中份38阳性样品、137份阴性样品结果一致，共5份样品结果不一致。敏感性为92.68%(38/41)，特异性为98.56%(137/139)，总符合率为97.22%(177/180)。CSFV与PRRSV混合感染4份，结果完全一致。

2.8 临床应用对2019年12月至2020年1月华中农业大学动物疫病诊断中心收到的来自湖北省、湖南省、江西省14家规模化猪场的保育及育肥阶段的839份抗凝血样品进行检测。

在共计检测样品839份中，使用本研究建立的检测方法，共检出ASFV阳性核酸0份，阳性率0.00%；CSFV阳性核酸103份，阳性率12.28%；PRRSV阳性核酸249份，阳性率29.68%。混合感染份27，混合感染率3.22%(图12)。

图12 ASFV、CSFV、PRRSV及混合感染检出率

3 讨论

3.1 方法的建立本研究设计的通用型检测方法，对可疑样品进行初步检测，针对阳性样品须再进行测序依据基因组分析进行分型[5-6]，这与目前大部分实验室检测工作方向一致，并且本研究方法优势在于可检测多种病原。本研究以国标方法作为金标准，进行Kappa检验，结果表明所建方法具有较高的敏感性。

CSFV 5′UTR序列保守性很高，常根据这一区域设计特异性引物，进行感染CSFV的诊断工作。绝大多数已建立的RT-qPCR方案都使用高度保守的5′UTR作为CSFV检测的目的基因[7]。本研究在设计引物时，参考了CSFV已报道的所有的亚型，从而尽可能地避免漏检。在PRRSV基因组中，ORF6基因最为保守，其在欧洲型和美洲型毒株间同源性高于包括ORF7在内的其他片段[8]，因此本研究选用ORF6作为PRRSV通用型检测的候选目的基因。

3.2 检测样品的选择对于ASFV、CSFV、PRRSV这3种病原的检测来说，血液样品以及组织样品具有较高的病毒载量[9-12]，而口腔液样品采样更为便捷[13-15]。本研究在方法对比中选用了血液、口腔液和组织等样品，可对比不同类型样品检测的效果，而在方法应用中血液样品则能更加真实地反映临床情况。

3.3 方法对比为了最大限度验证本研究方法的可靠性，与国家标准方法或国家推荐诊断方法进行了对比试验，结果表明该方法具有较高的敏感性和特异性。而本研究方法的优势是可同时检测3种病原，节省检测的时间和成本。对于疾病净化来说，漏检可能引起严重的后果。本研究方法立足于通用型检测，在具有较高灵敏性、特异性的同时，可检测ASFV、CSFV、PRRSV各个亚型毒株，尽可能降低漏检概率。

3.4 数据分析在对839个临床样品的检测结果中，PRRSV检出率最高达到29.68%，CSFV为12.28%，CSFV与PRRSV混合感染率为3.22%。

综上所述，本研究建立了可以同时检测ASFV、CSFV、PRRSV的多重qPCR方法，为用于临床监测、鉴别和净化ASF、CSF、PRRS这3种猪病提供了有效支持。从临床应用中的结果整体来看，CSFV、PRRSV总核酸检出率稳定。