闫可心，闫宗斌，韩金成，薛书江，于龙政，宋建臣，许应天

(延边大学 农学院，吉林 延吉 133002)

细胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPPs)也称为膜穿透肽(membrane penetrating peptide,MPPs)、转运蛋白(membrane transduction peptides，MTPs)、蛋白质转导域(protein transductions，PTDs)[1]、“特洛伊木马”肽(Trojan horse peptides) 或转导肽(transduction peptide) 等[2]，是一类氨基酸数目为5～30 的小分子多肽。由于它可以运载亲水分子如核酸、肽、蛋白质等生物大分子物质进入细胞内之后可降解，却不会引起细胞损伤，而广泛应用于分子生物学、医药学等各个领域[3-7]，但至今尚未有有关基因转化方面的报道。因此，本研究探讨CPPs介导基因转化的可行性，为分子生物学中的基因转化提供一种新的方法。

1 材料与方法

1.1 血液样本、载体和菌液瑟氏泰勒虫阳性抗凝血采自吉林省珲春市天一牧场，保存于本实验室。DH5α菌、BL21(DE3)菌、pET-30a(+)、pMD19-T simple vector均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 主要试剂DNaseⅠ、ExTaq DNA聚合酶购自TakaRa公司；限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、T4 DNA ligase、T4 DNA ligase Buffer、血液DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒(Plasmid Mini Kit Ⅰ)和凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)均购自OMEGA公司；广谱蛋白marker、IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、考马斯亮蓝R-250、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒均购自北京索莱宝公司；其他为分析纯试剂。

1.3 CPPs工作液的制备根据田菊等[8]报道的新型穿膜肽序列，委托北京博奥森公司合成。其细胞穿膜肽序列为：CGRLWMRWYSPWARRYGC。用ddH2O溶解CPPs，最终质量浓度为2.35 g/L，分装冻存于-20℃冰箱备用。

1.4 CPPs-DNA复合物最适比例将CPPs工作液与5 μL已知浓度的pMD19-T质粒按照电荷比为0∶1,1∶1,2∶1,4∶1,8∶1,16∶1,32∶1和64∶1混合[9]，涡旋混匀，在室温下孵育30 min，得到不同电荷比的CPPs复合物溶液。将CPPs复合物与10×loading Buffer混合，用1%的琼脂糖凝胶电泳初步确定CPPs与质粒pMD19-T结合比例。按上述方法制备不同复合物，每个样品加……