王 洋， 唐 娟， 孙 鹏， 林师佈， 张 旭△

(1.内江市第一人民医院，四川 内江 641000； 2.海南医学院第一附属医院， 海南 海口 570100)

结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，2018年结直肠癌的确诊病例超过180万，是全球第三大常见癌症[1，2]。大约25%的结直肠癌患者在最初诊断时就有转移性疾病，而且在他们的疾病进展过程中，有相似比例的患者会发生转移[3，4]。目前，结直肠癌死亡率依然居高不下，主要原因是缺乏有效的治疗药物。因此，深入研究一种毒副作用小、价格低廉的药物治疗结直肠癌显得尤为重要。山慈菇(Iphigenia Indica)为常用的抗肿瘤中药之一，具有燥湿化痰、消肿和软坚散结等作用[5]。近年来多项研究报道显示，山慈菇也有广泛的抗肿瘤、抗炎、抑制血管生成以及抑制疤痕增殖等作用，但其抗结直肠癌的作用机制尚未完全阐明[6，7]。星形细胞上调基因-1(astrocyte elevated gene-1，AEG-1)也被称为异黏蛋白，最初在人类星形胶质细胞受人免疫缺陷病毒1(human immunodeficiency virus，HIV-1)感染或经肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)干预后被识别，是肿瘤发生发展过程中的一种重要癌基因[8]。AEG-1在多种恶性肿瘤中呈异常高表达，并且与预后不良有密切关系[9-11]。姜维民等[12]研究表明，AEG-1蛋白表达升高可能在结直肠癌的发生发展中起重要作用。王军等[13]通过免疫组织化学方法检测结直肠癌组织中AEG-1的表达水平，发现AEG-1在结直肠癌中高表达，且与肿瘤体积、Dukes分期、浸润深度、淋巴结转移及预后密切相关。以上研究表明，AEG-1过表达与结直肠癌的发生发展密切相关，但通过何种机制发挥作用，目前尚不明确。因此本研究以人结直肠癌SW480细胞为研究对象，观察山慈菇提取物对SW480细胞增殖和凋亡的影响，并初步探究其分子生物学机制。

1 材料

1.1 细胞

人结直肠癌SW480 细胞购自上海一研生物科技有限公司，货号EY-8719。

1.2 主要药物及试剂

山慈菇(云南独蒜兰的干燥假鳞茎)(货号7543437)，北京同仁堂药店；AEG-1沉默重组慢病毒颗粒及阴性对照慢病毒颗粒，上海吉凯基因化学技术有限公司，NM_178812；DMEM和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(货号C11995500BT、10099-141)美国Gibco公司；CCK-8试剂盒(货号CA1210)、1%草酸铵结晶紫染色液(货号G1062)，购自北京索莱宝科技有限公司；细胞凋亡Hoechst染色试剂盒(货号C0003)，碧云天生物技术有限公司；一抗AEG-1、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2-associated X的蛋白质(Bax)、内参GAPDH(货号WL03007、WLO1556、WLO1637、WLO1114)和二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(货号WLA023)，沈阳万类生物科技有限公司。

1.3 主要仪器

IX53奥林巴斯倒置显微镜，(上海普赫光电公司)；MHFL-2000倒置荧光显微镜，(广州市明慧科技有限公司)；Varioskan LUX 多功能酶标仪、NanoDrop 2000超微量紫外可见分光光度计购自美国Thermo公司。

2 方法

2.1 细胞培养

人结直肠癌细胞株SW480用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养液置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中进行培养。

2.2 山慈菇提取物制备

精确称量200 g山慈菇，粉碎，去离子水加热、冷却、过滤，再加入95%乙醇洗涤、蒸发、浓缩干燥后得到山慈菇干粉24 g。采用DMEM完全培养基制备山慈菇提取液浓度为 100、200、400、600和800 mg/L，经0. 22 μm 微孔滤膜除菌和高压灭菌后供实验使用。

2.3 细胞转染

将对数生长期的SW480细胞按5×104个/孔接种于6孔板中，在37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养。24 h后，以转染手册中推荐的multiplicity of infection(MOI)值进行感染，72 h后选取荧光率大于90%的孔继续培养。Western blot检测AEG-1的沉默效果，再进行后续实验。转染成功后分组为阴性对照组及AEG-1慢病毒转染组。

2.4 CCK-8法检测细胞增殖

取对数生长期SW480细胞，在96孔板中24 h后各孔分别加入100 μL含有不同浓度山慈菇提取物完全培养液 (100、200、400、600和800 mg/L)，培养24 h、48 h和72 h后加入CCK-8试剂(10 μL)，培养板在细胞培养箱内孵育2 h后，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，并计算细胞抑制率(%)=1-[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100，每组实验重复6次。

2.5 平板克隆实验检测细胞克隆形成能力

取对数生长期SW480细胞以500个/孔接种于6孔板中，加入终浓度为0、400和600 mg/L的山慈菇提取物处理24 h，更换常规培养基继续培养14 d。洗涤后进行固定染色，洗去染色液，采集照片并计算细胞接种存活率即克隆形成率 =(克隆数/接种细胞数)×100%。

2.6 细胞形态学观察

取对数生长期SW480细胞，以每孔5×105个/mL细胞密度接种于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱待细胞生长贴壁后，加入终浓度为0、400和600 mg/L的山慈菇提取物处理24 h，行Hoechst染色观察细胞凋亡，严格按照说明书操作进行，奥林巴斯倒置显微镜观察细胞形态变化并采集图片。

2.7 Western blot检测蛋白表达

加入RIPA 裂解液(150 μL)裂解各组细胞、提取总蛋白，总蛋白样品用BCA法测定蛋白浓度。取蛋白样品25 μg，经SDS-PAGE电泳分离后转移至PVDF膜，用封闭液(5% BSA/TBST)封闭1 h，加入一抗AEG-1、Bcl-2、Bax和GAPDH(抗体均1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入二抗(1∶10000)室温下孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL系统显影。以 GAPDH 作为内参，采集条带灰度值用Image J 软件计算：相对表达量=目的条带灰度值/内参条带灰度值。

2.8 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，采用方差分析和t检验，所有实验至少重复3次，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 山慈菇提取物对SW480增殖的影响

表1示，与空白组比较，100和200 mg/L山慈菇提取物组作用24 h、48 h和72 h后，对细胞比较增殖抑制率差异无统计学意义。其余各浓度山慈菇提取物作用不同时间点，增殖抑制率与空白组比较均有显著提高(P<0.05)。依据CCK-8实验结果，选取400和600 mg/L山慈菇提取物进行后续实验。

表1 山慈菇提取物对SW480细胞增殖影响比较

3.2 山慈菇提取物对SW480细胞克隆形成能力的影响

图1表2示，与空白组比较，山慈菇提取物(400和600 mg/L) 细胞组克隆形成率逐渐降低(P<0.01)。

注：A、B和C分别为0 mg/L、400 mg/L和600 mg/L山慈菇提取物组。

表2 山慈菇提取物对SW480细胞克隆形成率的比较

3.3 山慈菇提取物对SW480细胞形态的影响

图2示，Hoechst 33258 染色后可见，0 mg/L山慈菇提取物干预后的细胞形态一致，细胞核呈正常的蓝色，亮度均匀；不同浓度的山慈菇提取物(400和600 mg/L)作用后出现细胞核固缩或呈碎裂块，且颜色有些发白，生成凋亡小体(红色箭头)。

注：A、B和C分别为0 mg/L、400 mg/L和600 mg/L山慈菇提取物组

3.4 山慈菇提取物对SW480细胞AEG-1、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

图3表3示，与空白组比较，山慈菇提取物(400和600 mg/L)细胞组，AEG-1和Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.01)，Bax蛋白表达明显增加(P<0.01)，表明山慈菇提取物可呈剂量依赖性下调AEG-1和Bcl-2蛋白表达以及上调Bax蛋白表达。

注：A、B和C分别为0 mg/L、400 mg/L和600 mg/L山慈菇提取物组；星形细胞上调基因-1(astrocyte elevated gene-1，AEG-1)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2-associated X的蛋白质(Bax)

表3 山慈菇提取物对SW480 AEG-1、Bcl-2和Bax蛋白表达统计结果比较

3.5 沉默AEG-1基因对AEG-1、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

图4表4示，与阴性对照组比较，AEG-1沉默慢病毒转染组细胞中AEG-1蛋白表达明显降低(P<0.05)，提示AEG-1基因表达受到抑制；同时沉默AEG-1组细胞中Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05)，Bax蛋白表达明显增加(P<0.05)，提示沉默AEG-1可下调Bcl-2蛋白表达和上调Bax蛋白表达。

注：A. 阴性对照组；B. AEG-1沉默慢病毒转染组；星形细胞上调基因-1(astrocyte elevated gene-1，AEG-1)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2-associated X的蛋白质(Bax)

表4 沉默AEG-1对SW480 细胞AEG-1、Bcl-2和Bax蛋白表达统计结果比较

3.6 沉默AEG-1对SW480细胞活性的影响

表5示，与阴性对照组比较，AEG-1沉默慢病毒转染组细胞活性均明显降低(P<0.05)，提示沉默AEG-1可抑制SW480细胞增殖。

表5 沉默AEG-1对SW480细胞活性影响比较

3.7 沉默AEG-1对SW480细胞克隆形成能力的影响

图5表6示，与阴性对照组比较，AEG-1沉默慢病毒转染组细胞克隆形成率均明显降低(P<0.05)，提示沉默AEG-1可抑制SW480细胞增殖。

注：A. 阴性对照组；B. AEG-1沉默慢病毒转染组

表6 沉默AEG-1对SW480细胞克隆形成率比较

3.8 沉默AEG-1对SW480细胞形态的影响

图6示，与阴性对照组比较，AEG-1沉默慢病毒转染组细胞出现细胞核固缩或呈碎裂块，且颜色有些发白，生成凋亡小体(红色箭头)，提示沉默AEG-1可抑制SW480细胞凋亡。

注：A. 阴性对照组；B. AEG-1沉默慢病毒转染组

4 讨论

山慈菇是普遍存在于自然界中的兰科植物，其成本低、毒副作用小，同时具有消炎去肿、防止组织黏连和提高机体免疫力等多种药理作用[5,14]，并对多种肿瘤如人结直肠癌、乳腺癌、甲状腺癌等具有抑制作用[5,15-17]，但山慈菇提取物抗人结直肠癌增殖作用及其具体机制尚未充分阐明。文章采用山慈菇提取物作用于人结直肠癌SW480细胞，发现其能有效抑制SW480细胞活性，细胞克隆形成能力明显降低，差异有统计学意义。细胞形态学观察实验Hoechst 33258染色后，与空白组比较，实验组可见SW480细胞形态皱缩并形成凋亡小体。研究表明，山慈菇提取物对人结直肠癌SW480细胞增殖具有显著抑制作用，同时也具有促进细胞凋亡的作用。

Bcl-2和Bax是凋亡相关蛋白，在凋亡信号通路中起决定性作用。正常条件下，Bax蛋白以单体形式存在于健康的细胞质中[18，19]。张晓莉等[20]研究证实，红花多糖能够显著抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖，并诱导SMMC-7721细胞凋亡，其作用机制可能与上调Bax的表达及下调Bcl-2的表达相关。研究西黄丸对人结直肠癌细胞SW480凋亡的影响，结果显示西黄丸含药血清增加了Bax蛋白表达，抑制Bcl-2蛋白表达，具有促进细胞凋亡作用[21]。另有藤黄酸对体外培养人结直肠癌细胞株增殖凋亡的影响实验表明，随着藤黄酸浓度增加，细胞凋亡的百分比增加，且Bax蛋白表达明显增加，Bcl-2蛋白表达降低[22]。本研究结果显示，山慈菇提取物在体外促进人结直肠癌SW480细胞的凋亡；进一步的Western blot实验结果显示，山慈菇提取物可呈剂量依赖性下调人结直肠癌SW480细胞中Bcl-2蛋白表达水平，同时上调Bax蛋白表达水平。表明山慈菇提取物可通过调控Bcl-2和Bax蛋白的表达，促进人结直肠癌SW480细胞的凋亡。

AEG-1于2002年被鉴定和克隆，是通过HIV-1和TNF-α诱导人类星形胶质细胞发现的一种新型蛋白[23]。近年来多项研究表明，AEG-1作为致癌因子在结直肠癌、肝癌、黑色素瘤等多种类型肿瘤的发生发展过程中扮演着重要角色，并且与临床分型、病理分期、转移和预后密切相关[24，25]。有研究表明，白细胞介素-8 (Interleukin-8，IL-8)通过与AEG-1相互作用，促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而下调AEG-1表达则可减弱上述现象[26]。另有研究发现，沉默AEG-1表达可抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导其凋亡[27]。也有报道显示，通过检测结肠癌组织和相应癌旁组织中AEG -1表达发现，AEG-1阳性表达主要位于细胞浆或/和细胞膜，其在癌组织中的阳性表达率为73.1%(57/78)，显著高于其在癌旁正常组织中的表达24.4%(19/78)，差异有统计学意义；且 AEG-1的表达与患者的组织分化程度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期密切相关[28]。在证实山慈菇提取物可以抑制人结直肠癌SW480细胞增殖并诱导凋亡的基础上，继续检测山慈菇提取物对SW480细胞中AEG-1表达的影响，结果显示在SW480细胞中AEG-1蛋白呈阳性表达，山慈菇提取物可剂量依赖性地抑制AEG-1蛋白表达。为进一步探究山慈菇提取物对Bcl-2和Bax蛋白表达的调控机制，采用shRNA干扰技术抑制SW480细胞中AEG-1基因表达，结果显示沉默AEG-1基因表达可显著抑制Bcl-2和促进Bax蛋白表达，同时抑制SW480细胞增殖和促进其凋亡。本研究结果表明，山慈菇提取物可通过下调 AEG-1蛋白表达，进而下调Bcl-2和上调Bax蛋白表达，从而抑制SW480细胞增殖并诱导凋亡。

本研究结果表明，山慈菇提取物可明显抑制人结直肠癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，该作用呈剂量依赖性，其作用机制可能与抑制AEG-1蛋白表达、继而下调Bcl-2、上调Bax蛋白表达水平有关。山慈菇提取物的研发应用有望成为治疗人结直肠癌等肿瘤疾病的新方式。