涂文玲，林泽豪，连雄瀚，甘慧娟*

(1.福建中医药大学 中医证研究基地，福建 福州 350122；2.福建省中医健康状态辨识重点实验室，福建 福州 350122)

慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis，CAG)是胃癌发展过程中的关键环节，被视为胃癌前疾病，近年来发病率呈明显上升趋势，癌变率为1.2%～7.1%，并向低龄化发展。西医治疗CAG主要采取根除Hp、胃黏膜保护等方法[1]，临床取得了一定疗效，但多以对症治疗为主，易反复发作，因而迫切需要寻求新方法用以防治CAG。中医药在整体观念指导下进行辨证论治，能够有效改善CAG临床症状和逆转胃黏膜萎缩，具有很好的防治作用[2-3]。中医认为CAG患者久病体虚，久病必瘀，血瘀始终是CAG的病理因素，贯穿始终[4-6]。三棱性平，莪术性温，均归肝、脾经，均具有破血行气、消积止痛之功效，两者常常用来治疗CAG，郭云协等[7]在治疗CAG伴肠化过程中加入三棱、莪术破血消积，起到逆转肠化生的作用。虽然三棱、莪术在临床得到肯定，但是其作用机理并不明确，因此本研究运用网络药理学对三棱、莪术治疗CAG作用机理进行研究，并利用分子对接技术进行验证，以期为后续研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 三棱-莪术中药成分和靶点筛选

利用TCMSP数据库(https：//tcmspw.com/tcmsp.php)检索“三棱”“莪术”两味中药，以口服生物利用度(OB≥30%)和类药性(DL≥0.18)进行筛选，收集三棱-莪术的活性成分，同时检索活性成分的蛋白靶标，将蛋白靶标一一输入Uniprot(https：//www.uniprot.org/)数据库进行基因名转化。以“chronic atrophic gastritis”为检索词在Gene Cards数据库(https：//www.genecards.org/)、OMIM数据库(https：//omim.org/)、PharmGKB数据库(https：//www.pharmgkb.org/)、DrugBank数据库(https：//go.drugbank.com/)进行检索，综合各个数据库检索得到的靶点，并去除重复项，得到CAG疾病相关靶点。

1.2 韦恩图、蛋白网络互作(PPI)网络及药物-活性成分-靶点网络构建

利用Venny(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在线工具绘制韦恩图，获取三棱-莪术和CAG的共同靶点，将共同靶点输入String数据库(https：//string-db.org/)，设置置信度为0.4，制作PPI网络图，用Cytoscape3.8.0 软件进行可视化，最后将活性成分-共同靶点信息导入Cytoscape3.8.0软件，绘制出活性成分-共同靶点网络图。

1.3 共同靶点的GO、KEGG富集分析和分子对接

利用R软件进行GO和KEGG富集分析，以P<0.05为差异有统计学意义，在PDB、PubChem数据库获取三棱-莪术的主要活性成分和核心靶点的晶体结构，再借助AutoDockTool Vina软件将主要活性成分与核心靶点进行分子对接，搜集结合值，佐证三棱-莪术治疗CAG的合理性。

2 结果

2.1 三棱-莪术中药活性成分及靶点筛选结果

通过TCMSP数据库收集、筛选(OB≥30%、DL≥0.18)出三棱-莪术活性成分8个，其中三棱5个、莪术3个。对该活性成分进行靶点查找，剔除未找到靶点的活性成分，获取5个有效活性成分，见表1。对通过TCMSP数据库找到的药物靶点进行基因名转化，去除重复项，共得到66个靶点；从GeneCards、OMIM、PharmGKB、DrugBank数据库获得疾病靶点377个；将三棱-莪术的作用靶点和疾病靶点分别输入Venny在线工具绘制韦恩图取交集，匹配得到三棱-莪术治疗CAG的共同靶点9个，见图1。

注：A：韦恩图；B：三棱-莪术与CAG的共同靶点。图1 疾病共同作用靶点

表1 三棱-莪术的活性化合物

2.3 网络构建及蛋白互作结果

利用Cytoscape3.8.0软件构建出活性成分-共同靶点模型，见图2A，其中绿色节点代表该活性成分来自三棱(4个)，绿色和蓝色各半节点代表该活性成分来自三棱和莪术(1个)，黄色节点代表药物与疾病的共同靶点(9个)。最后利用String数据库和Cytoscape 3.8.0软件进行制作共同靶点PPI网络图，见图2B。依据所构建的结果，发现CASP3、PPARG、PTGS2、JUN、NOS2是三棱-莪术治疗CAG的核心靶点(Degree>4.89(平均值))，见表2；且β-谷甾醇、芒柄花黄素是三棱-莪术治疗CAG的主要活性成分(Degree>3.6(平均值))，见表3。

注：A：活性成分-靶标网络图；B：核心靶点的相互作用网络图。图2 药物与CAG 之间网络

表2 PPI网络中靶点的相关参数

表3 活性成分-共同靶点网络图中活性成分的相关参数

2.4 GO和KEGG富集分析

通过R软件对9个共同靶点进行GO功能富集分析，根据P<0.05，得到生物过程(Biological process，BP)条目878个，细胞组成(Cell composition，CC)条目21个，分子功能(Molecular function，MF)77个，其中生物过程主要富集于对细菌源分子的反应、细胞对外界刺激的反应等，细胞组成主要富集于RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物、线粒体外膜等，分子功能主要富集于半胱氨酸型内肽酶活性参与细胞凋亡过程、死亡受体结合等，见图3，红色越深代表P值越小，节点越大代表富集靶点数量越多。

图3 GO富集结果信息(top10)

通过R软件对9个共同靶点进行KEGG通路富集分析，根据P<0.05筛选到74条信号通路，主要涉及IL-17信号通路、TNF信号通路、P53信号通路、HIF-1信号通路等，见图4，红色越深代表P值越小，节点越大代表富集靶点数量越多。

图4 KEGG富集结果信息(top30)

2.5 分子对接结果

核心靶点CASP3、PPARG、PTGS2、JUN、NOS2在PDB数据库进行搜索，获得晶体结构ID依次为2C1E、2Q59、5F19、1JNM、2NSI，再与核心活性成分进行分子对接，得出其对接的结合能(kcal/mol)数值，见表4。结合能为负值表明配体和受体可以自发结合[8]，并且结合能越低，该结合构象越稳定，发生作用的可能性越大[9]。

表4 分子对接结合能信息

3 讨论

当前CAG被认为是胃癌的癌前病变，其经历的过程为：正常胃黏膜-慢性浅表性胃炎-萎缩性胃炎-肠上皮化生-异型增生-胃癌，随着病情加重，胃黏膜萎缩可发展为肠上皮化生，这其实与叶天士“久病入络”“久痛入络”学说有异曲同工之处[10]。现代医学认为胃黏膜血流量减少、微循环灌注差，进而导致CAG，这与中医瘀血具有很大相似性。研究发现胃黏膜萎缩伴重度肠上皮化生多以胃络瘀血证为主[11]。三棱、莪术作为活血化瘀的代表中药，现代药理学研究表明，两药均有改善血液流变学、扩张血管、调节血管通透性和抗癌作用[12]；临床研究发现三棱-莪术药对可通过显著抑制内皮细胞增殖、 抑制肿瘤细胞生成、直接杀死肿瘤细胞、抑制血管生成、阻断信号传导通路等机制起到治疗胃癌的作用[13-15]。近年来，愈来愈多研究者对活血化瘀治疗CAG进行临床研究，在治疗一些肠上皮化生CAG患者过程中，可以适当选加具有一定防癌、治癌作用的清热活血之品，通过改善胃黏膜微循环状态，增加胃黏膜血流，可逆转黏膜腺体萎缩和肠上皮化生等病变[16]。

通过分析PPI网络分析和“药物-活性成分-靶点”网络的相关参数，可知三棱-莪术治疗CAG的核心活性成分是 β-谷甾醇和芒柄花黄素，β-谷甾醇是一种安全的天然药物，具有抗炎、抑制肿瘤等广泛的药理活性，研究表明β-谷甾醇可通过提升血清 NO 含量而提高受损胃黏膜的修复能力[17]。芒柄花黄素为一种生物活性异黄酮，具有完善的生物功能和抗肿瘤作用[18]，研究发现芒柄花黄素可防止血管生成和癌转移，可抑制人胃癌 MKN-45 细胞株的增殖[19]。三棱-莪术主要作用靶点是CASP3、PPARG、PTGS2、JUN、NOS2。CASP3 是在整个凋亡通路中起到枢纽作用的重要凋亡信号分子[20]，研究发现CASP3的表达在人的胃癌组织比正常组织要明显降低[21]。PPARG是由配体激活的转录因子，研究发现PPARG在胃癌组织的低表达可能是胃癌转移的早期事件[22]。PTGS2是一种促炎症因子，其高表达与肿瘤细胞快速生长、凋亡受抑制以及浸润转移有关[23]。JUN原癌基因的激活在肿瘤的发生发展中起到重要作用，能调控细胞的生长、分化、凋亡[24]。NOS2在多种生物过程中充当生物介质，包含抗肿瘤活性，研究发现，NOS2与肿瘤血管形成有关，可能通过抑制NOS2的表达来抑制肿瘤血管的发生，这可能是治疗肿瘤的一种方法[25]。因此，三棱-莪术的β-谷甾醇、芒柄花黄素这两种核心成分可能是通过抗炎、调控细胞凋亡、抑制肿瘤血管的形成对CAG起到治疗作用。

GO功能富集发现，三棱-莪术活性成分的生物学过程涉及脂多糖、细菌源分子的反应等，分子功能主要富集于半胱氨酸型内肽酶活性参与细胞凋亡过程等，KEGG通路富集分析可知其主要涉及IL-17信号通路、TNF信号通路、P53信号通路、HIF-1信号通路等。IL-17 由辅助性 T 细胞(Th17)及先天性免疫细胞等分泌的促炎症因子，在多种炎性反应发挥关键作用，研究发现 IL-17可通过NF-κB 信号通路刺激下游效应因子发生转录，参与胃癌的免疫调控以及促进胃癌的发生发展[26]。TNF具有多种生物学功能，可诱导细胞增殖分化，抑制细胞凋亡，促进炎症和肿瘤发展，加重CAG[27]。P53是一种抑癌基因，能抑制细胞增殖、生长和转化，在CAG过程中，病情越严重，p53的表达率越高[28]。HIF-1由HIF-α和HIF-β组成[29]，其中HIF-1α在缺氧环境下可促进肿瘤血管生成，因此抑制HIF-1α的表达可减少肿瘤血管生成[30]。因此，三棱-莪术可能是通过抗炎、调控细胞凋亡、抑制肿瘤血管形成来达到治疗CAG的效果。分子对接显示三棱-莪术的核心活性成分与核心靶点有着很好的结合性，发挥作用的可能性极大。

综上，本研究从三棱-莪术中筛选出两个核心活性成分(β-谷甾醇和芒柄花黄素)和5个核心靶点(CASP3、PPARG、PTGS2、JUN、NOS2)进行结合的潜能，并且得出三棱-莪术治疗CAG的可能机制是通过抗炎、调控细胞凋亡、抑制肿瘤血管形成，这为治疗CAG的中药天然药物和单体药物的研发提供了新思路。但计算机生物方法本身具有局限性，我们在接下来将结合动物实验来进行验证。