刘沁如，向 茗，瞿昊宇，陈光宇，谢梦洲*

(1.湖南中医药大学 中医学院，湖南 长沙 410208；2.湖南省药食同源功能性食品工程技术研究中心，湖南 长沙 410208；3.中医心肺病证辨证与药膳食疗重点研究室，湖南 长沙 410208；4.湖南中医药大学 信息科学与工程学院，湖南 长沙 410208)

糖尿病是一种以糖代谢异常为特征的代谢性疾病，其中最常见的类型是2型糖尿病，约占全部糖尿病患者的90%[1]。胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要特征之一，其主因是脂肪代谢异常；而血脂异常又是糖尿病的常见并发症之一。全国营养状况调查研究发现，糖尿病患者中20%～90%患有高脂血症[2]。因此，防治2型糖尿病合并脂代谢异常具有重要意义。目前临床上使用的降糖药物中除二甲双胍和阿卡波糖片在糖尿病前期人群中长期应用的安全性较为可靠外，其他药物长期应用时的安全性尚未有充足的证据支持[3]。调节血脂的药物如他汀类、贝特类等，虽疗效显著，但有肝损伤、横纹肌溶解等不良反应[4]。据报道[5]，中医药调理和治疗2型糖尿病合并高脂血症不仅治疗效果好，且安全系数高，值得推广。除常规药物治疗外，功能食品对于辅助降糖降脂有特殊优势。本研究的研究对象新会陈皮黑茶茶包是市场上已出售的普通食品，主要原料为陈皮、黑茶，已有相关文献[6-7]发现其有辅助降糖降脂作用，故该茶包可开发为辅助降糖降脂的保健食品。现已知陈皮、黑茶中降糖降脂的主要活性成分分别为橙皮苷、川陈皮素、橘皮素及茶多糖[8-10]，因该茶包的使用方法为取一包(10 g)加300～500 mL的沸水浸泡5 min后即可饮用，此剂型及服用方法不能将所有的有效活性成分析出，故本研究将其改成颗粒剂。此外，通过查阅文献发现，上述降糖降脂活性成分的提取工艺条件差异较大，无法照搬套用，故为了最大限度地提取陈皮、黑茶降糖降脂的功能成分，本研究探讨陈皮、黑茶的提取工艺条件对降糖降脂活性成分的影响，确定最优提取工艺参数，为陈皮黑茶颗粒的工业化生产及降糖降脂作用的药效学实验提供依据。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

新会陈皮饮片、安化黑茶(均购自广东金威宝健康产业有限公司，批号：C0120191224a)；橙皮苷对照品(HPLC≥98%)(上海源叶生物科技有限公司，批号：P06D9F77001)；川陈皮素对照品(HPLC≥98%)(上海源叶生物科技有限公司，批号：N10J10R90249)；橘皮素对照品(HPLC≥98%)(上海源叶生物科技有限公司，批号：H09M7K14409)；无水葡萄糖(HPLC≥98%)(上海沃凯生物技术有限公司，批号：20161219)；液相色谱柱(月旭科技上海股份有限公司，填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶UltimateXB-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm)；试剂为分析纯；实验用水为纯化水或超纯水。

1.2 仪器与设备

电子天平(东京岛津仪器有限公司，型号：ATX124型124 g-0.000 1 g)；电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器，型号：DIKW-S-6)；10L旋转蒸发器(日本东京理化，型号：N-3010)；超声波清洗器(昆山美美超声仪器，型号：KM5200DE)；冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：SCIENTZ-10N)；调速多用振荡器(常州荣华仪器制造有限公司，型号：HY-4)；高速冷冻离心机(长沙英泰仪器有限公司，型号：TGL18W)；ltimate3000高效液相色谱系统(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，包括G1316A四元梯度泵，G1313A标准型自动进样器，G1316A恒温箱，G1314A紫外检测器，AgilentChemstation色谱工作站)；紫外-可见分光光度计(北京莱伯泰科，型号：UV900B)；水分测定仪(深圳市冠亚水分仪科技，型号：SFY-20BL)。

2 实验方法

2.1 橙皮苷、川陈皮素及橘皮素的HPLC测量方法[11]

2.1.1 色谱条件与系统适应性实验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；橙皮苷测量波长为283 nm，川陈皮素和橘皮素检测波长为330 nm。

表1 流动相比例及流速

2.1.2 对照品溶液的制备 (1)橙皮苷对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品10 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得1.0 mg/mL橙皮苷对照品溶液，再取橙皮苷对照品浓溶液1.0 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，即得每1 mL含橙皮苷0.2 mg的橙皮苷对照品溶液。

(2)川陈皮素对照品溶液的制备：取川陈皮素对照品10 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得1.0 mg/mL川陈皮素对照品浓溶液，再取川陈皮素对照品浓溶液1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，即得0.1 mg/mL川陈皮素对照品溶液A；取2.5 mL川陈皮素对照品溶液A，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，即得25 μg/mL川陈皮素对照品溶液B。

(3)橘皮素对照品溶液的制备：取橘皮素对照品10 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得1.0 mg/mL橘皮素对照品浓溶液，再取橘皮素对照品浓溶液1.5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，即得0.15 mg/mL橘皮素对照品溶液A；取1.0 mL橘皮素对照品溶液A，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，即得15 μg/mL橘皮素对照品溶液B。

2.1.3 供试品溶液制备 取新会陈皮9个正交试验所得干浸膏细粉各0.2 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)60 min，放冷后再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，取上清液8 mL于离心管中，在4 000 r/min的条件下离心10 min，取上清液，过滤，取续滤液。

2.1.4 测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪测定峰面积积分值，见图1-图6。

图1 橙皮苷对照品色谱

图2 川陈皮素对照品色谱

图3 橘皮素对照品色谱

图4 陈皮干浸膏供试品色谱

图5 橙皮苷阴性对照品色谱

图6 川陈皮素和橘皮素阴性对照品色谱

2.2 陈皮提取工艺条件[12-14]

2.2.1 陈皮提取基本方法 取陈皮饮片适当碎段，加入一定倍数的溶剂，浸泡一定时间，加热回流提取一定时间，过滤，滤渣进行第二次提取，加入一定倍数的溶剂，加热回流提取一定时间，过滤，合并两次滤液，将滤液在50 ℃、30 r/min、40 hPa的条件下减压浓缩至相对密度1.30 g/mL左右，再冷冻干燥成干浸膏粉。

2.2.2 陈皮正交设计试验方案及结果分析 将陈皮饮片适当碎段后均匀分成9份，每份精确称取50.0 g，按正交设计试验因素水平表及L9(3)4安排表进行实验，见表2及表3，以干浸膏得率、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素的百分含量为评价指标，统计分析结果见表4和表5。

表2 陈皮提取工艺因素水平

表3 陈皮提取工艺正交设计实验安排及结果

表4 橙皮苷、川陈皮素、橘皮素及干浸膏得率的因素间方差分析 (P<0.1)

表5 橙皮苷、川陈皮素、橘皮素不同提取条件各因素的水平间方差分析 (P<0.05)

以橙皮苷百分含量为评价指标：A因素水平间差异有统计学意义，A因素取3水平或2水平，B、C、D因素可任意取值；以川陈皮素百分含量为评价指标：A、B、C三个因素水平间差异均具有统计学意义，A因素取3水平，B因素取1水平，C因素取1水平或2水平，D因素可任意取值；以橘皮素百分含量为评价指标：A、B、C三个因素水平间差异皆有统计学意义，A因素取3水平，B因素取1水平或2水平，C因素取1水平，D因素可任意取值；以干浸膏得率为评价指标：A因素水平间差异有统计学意义，A因素取1水平，B、C、D因素可任意取值。

综上所述，A因素取3水平、B因素取1水平、C因素取1水平、D因素取任意值，考虑降低成本，D因素取3水平为佳，即第一次回流提取加入药材量35倍的70%乙醇，浸泡1.0 h，回流提取1.5 h；第二次加入药材量30倍的70%乙醇，回流提取1.0 h。

2.2.3 陈皮提取工艺的验证试验及结果 对陈皮中橙皮苷、川陈皮素、橘皮素的提取最优工艺条件进行验证：取三批陈皮中药饮片，每批1.0 kg，适当碎断，加70%乙醇回流提取2次，第一次回流提取加入药材量35倍的70%乙醇，浸泡1.0 h，回流提取1.5 h，过滤；第二次加入药材量30倍的70%乙醇，回流提取1.0 h，过滤，合并两次滤液，在50 ℃、30 r/min、40 hPa的条件下减压浓缩相对密度1.30 g/mL左右，再冷冻干燥成干浸膏粉，测得橙皮苷含量为11.25%，RSD=2.768%，川陈皮素含量为2.612%，RSD=2.598%，橘皮素含量为1.278%，RSD=2.869%，干浸膏得率为33.43%，RSD=2.834%，提取工艺验证结果皆接近或略高于正交设计试验中的最高值，表明此工艺条件可最大限度提取出降糖降脂活性成分，该提取工艺参数科学、合理、稳定、可行，适用于工业化生产。

2.3 硫酸-苯酚分光光度法测定黑茶中茶多糖的含量

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取经105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品20.4 mg，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.204 mg/mL无水葡萄糖对照品溶液。

2.3.2 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.7 mL、1.0 mL，分别置10 mL具塞刻度试管中，分别加超纯水补至2.0 mL，再分别精密加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸7 mL，密封，用调速多用振荡器混匀，放置10 min，置40 ℃水浴中保温15 min，取出，迅速冷却至室温，在490 nm的波长处测定吸光度，绘制标准曲线，得线性回归方程y=0.037 8x+0.024 7，线性相关系数r=0.999 5，结果表明葡萄糖浓度在0～20.4 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3.3 供试品溶液的制备方法[15]取黑茶9个正交设计试验所得干浸膏细粉约各0.5 g，加入80%乙醇100 mL先研磨使分散成混悬水溶液，再转移至三角瓶中，加热回流1.0 h，趁热过滤，滤渣与滤器用热80%乙醇30 mL分次洗涤，弃去滤液，滤渣连同滤纸置烧瓶中，加水150 mL，加热回流1.0 h，趁热过滤，用少量热水洗涤滤器，合并滤液与洗液，放冷，各干浸膏粉样品溶液用纯化水定容至250 mL，摇匀。

2.3.4 供试品溶液的测定方法[15-16]精密移取制备的供试品溶液1 mL，置10 mL具塞刻度试管中，加水补至2.0 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5 mL，密封，用调速多用振荡器混匀，放置10 min，取出，迅速冷却至室温，用超纯水定容至10 mL刻度，在490 nm的波长处测定吸光度(在1 h内测定完毕)，根据标准曲线线性回归方程计算多糖含量。

2.4 黑茶水提工艺条件研究[17-18]

2.4.1 黑茶提取基本方法 将黑茶加入一定倍数的水，浸泡一定时间，在一定的温度下加热回流提取一定时间，过滤，滤渣进行第二次提取，加入一定倍数的水，在一定的温度下加热回流提取一定时间，过滤，合并两次滤液在50 ℃、30 r/min、40 hPa的条件下减压浓缩至相对密度1.30 g/mL左右，再冷冻干燥成干浸膏粉。

2.4.2 黑茶正交设计试验方案及结果分析 取9份黑茶，每份50.0g，按正交设计试验因素水平表及L9(3)4安排表进行实验，见表6及表7，以干浸膏得率、茶多糖的百分含量为评价指标，统计分析结果见表8和表9。

表6 黑茶水提工艺因素水平

表7 黑茶水提工艺正交设计实验安排及结果

表8 茶多糖及干浸膏得率的因素间方差分析 (P<0.05)

表9 茶多糖不同提取条件各因素的水平间方差分析 (P<0.05)

以茶多糖百分含量为评价指标：A、B、C三个因素水平间差异皆具有统计学意义，A因素取3水平或2水平、B因素取3水平、C因素取2水平、D因素可任意取值；以干浸膏得率为评价指标：B因素水平间差别具有统计意义，B因素取的3水平，A、C、D因素可任意取值。

综上所述，A因素取3水平或2水平、B因素取3水平、C因素取2水平、D因素可取任意值，考虑降低成本，A因素取3水平、D因素取3水平为佳，即第一次回流提取加入药材量25倍的水，浸泡1.5 h，回流加热1.0 h；第二次加入药材量25倍的水，回流加热0.5 h，水提温度均为100 ℃。

2.4.3 黑茶水提工艺的验证试验及结果 对黑茶水提最优工艺条件进行验证：取三批黑茶颗粒，每批1.0 kg，加水提取2次，水提温度均为100 ℃；第一次提取加入药材量25倍的水，浸泡1.5 h，回流加热1.0 h，过滤；第二次加入药材量25倍的水，回流加热0.5 h，过滤，合并两次滤液，在50 ℃、30 r/min，40 hPa的条件下减压浓缩至1.30 g/mL左右，再冷冻干燥成干浸膏粉，测得茶多糖含量为17.13%，RSD=2.756%，干浸膏得率为30.62%，RSD=2.819%，提取工艺验证结果皆接近或略高于正交试验中的最高值，表明此工艺条件可最大限度提取出降糖降脂活性成分，该提取工艺参数科学、合理、稳定、可行，适用于工业化生产。

3 讨论

陈皮、黑茶中所含的降糖降脂活性成分主要来自陈皮中的橙皮苷、川陈皮素、橘皮素等黄酮类化合物，黑茶中的茶多糖等，故本研究以橙皮苷、川陈皮素、橘皮素及茶多糖为评价指标研究提取工艺条件对降糖降脂活性成分的影响，为中试生产及降糖降脂作用的药效学实验提供理论依据和最优原料，避免因提取工艺条件不当制备的样品影响降糖降脂功能试验结果。

本实验结果表明，降糖降脂活性成分橙皮苷、川陈皮素、橘皮素在设计范围内随着乙醇浓度的增大而提取量增多，说明这类活性成分醇溶性好，陈皮采用70%乙醇提取可减少杂质的浸出，避免微生物污染，还可以增加产品的稳定性，缩小食用量，提高适用人群长期服用的顺应性。

根据查阅的相关文献，陈皮和黑茶的提取次数均为2次[13，17]，故本研究无须考察提取次数，采用2次即可；陈皮质地较软，易于掰碎，黑茶质地蓬松且体积较小，故本研究不考察粉碎度。