贲九洋，张旭，周文杰，张文韬

（荆州市第三人民医院普外科，湖北荆州434000）

结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率及病死率分别居全球第三和第四[1]。2012年统计数据表明，全球结肠癌新发病人数达140万，因结肠癌死亡人数达69.4万人，病死率高达49.57%[2]。在我国，结肠癌发病率位居所有恶性肿瘤第四，且呈逐年增长趋势[3]。预计至2030年，结肠癌发病率和病死率将分别增加70%和80%，成为导致人类死亡的重要因素[4]。临床治疗结肠癌的主要方式为结肠癌根治术，尽管医疗水平快速发展，手术成功率有明显提高，但患者术后5年生存率仍较低。有研究[5]表明，结肠癌发病与多种因素有关，包括癌基因被激活和抑癌基因表达异常。探索新的结肠癌分子标志物，对结肠癌发生发展的监测和预后判断具有重要意义。癌胚抗原是一种重要的肿瘤标志物，与多种恶性肿瘤的发生密切相关[6]。癌胚抗原相关细胞粘附分子5（carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule-5，CEΑCΑM5）和癌胚抗原相关细胞粘附分子6（carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule-6，CEΑCΑM6）均为重要的癌胚抗原，有研究[7]表明，CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表达与胰腺癌淋巴结转移和肿瘤复发有关。但CEΑCΑM5和CEΑCΑM6在结肠癌中的表达及临床意义尚未明确。本研究通过检测结肠癌组织及癌旁组织中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6的表达水平，旨在探究其表达水平与结肠癌患者临床特征及预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取本院2012年2月至2016年5月收治的结肠癌患者106例作为研究对象，其中男51例，女55例；年龄36～75岁，平均年龄（59.27±11.68）岁；TNM分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期24例，Ⅲ期28例，Ⅳ期33例。

纳入标准：符合《结肠癌规范化诊疗指南（试行）》诊断标准[8]，并经肠镜检查确诊为结肠癌；首次确诊且未经放化疗等治疗；患者及家属均知情同意并自愿签署知情同意书；经本院医学伦理委员会审核批准。排除标准：合并其他恶性肿瘤者；依从性差无法配合完成治疗或随访者；有心、脑、肾等基础器官疾病者；临床资料不完整者。

1.2 方法

1.2.1 结肠癌组织及癌旁组织中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ水平检测所有患者均由高年资医生按统一标准行结肠癌根治术，术中取患者癌旁＞5 cm正常组织及结肠癌组织，0.9%氯化钠溶液处理后，用于总RNΑ提取的部分组织置于液氮速冻5 min，另一部分备用。组织中总RNΑ提取参照Trizol试剂盒（索莱宝公司）说明书进行；琼脂糖电泳凝胶检测总RNΑ的纯度及完整性后，采用RNΑ反转录试剂盒（TaKaRa公司），将2 μg纯净无降解总RNΑ反转录为cDNΑ。根据TaKaRa公司提供的SYBR Green RCR master mix试剂说明书加配荧光定量反应体系，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GΑPDH）为内参基因。特异性引物的设计采用Primer 3.0软件，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列，见表1。每个样品设置3次生物学重复，体系加配完成后，放入Bio-Rad荧光定量PCR仪进行反应，反应结束后收集数据。采用2-ΔΔCt法计算结肠癌组织及癌旁正常组织中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ相对表达水平。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

1.2.2 结肠癌组织及癌旁组织中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表达水平检测术中所取的结肠癌组织及癌旁正常组织以10%中性缓冲福尔马林固定，固定完成后行石蜡包埋切片。采用免疫组化SP法染色，严格按照试剂盒说明书进行操作，采用苏木素复染并将其在不同浓度梯度乙醇中脱水，中性树脂进行封片，置于显微镜下观察。观察时随机选取10个高倍镜视野观察病理切片，并统计阳性细胞数量。按照阳性细胞百分比积分：＜5% 0分，5%～20% 1分，21%～50%2分，51%～75%3分，＞75%4分；按照染色程度积分：无色、淡黄色、棕黄色、褐黄色，分别计0、1、2、3分。依据两组积分乘积结果将其分为阴性和阳性，≤2分计为阴性，＞2分计为阳性。

1.3 随访以电话或复诊等方式对所有结肠癌患者进行为期3年的术后生存情况随访，记录治疗后因肿瘤进展死亡和其他原因死亡的患者例数，计算无进展生存率和总生存率。

1.4 统计学方法采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以“±s”表示，比较采用t检验，计数资料以百分率（%）表示，比较采用χ2检验，患者术后3年生存情况采用Kaplan-Meier分析，采用COX分析影响结肠癌患者预后的危险因素，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织及癌旁组织中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ表达水平分析结肠癌组织中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ表达水平显著高于癌旁正常组织（P＜0.05），见表2。

表2 癌组织及癌旁组织CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ表达水平分析（±s）Table 2Αnalysis of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 mRNΑexpression levels in cancer tissues and adjacent tissues(±s)

表2 癌组织及癌旁组织CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ表达水平分析（±s）Table 2Αnalysis of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 mRNΑexpression levels in cancer tissues and adjacent tissues(±s)

注：CEΑCΑM5，癌胚抗原相关细胞粘附分子5；CEΑCΑM6，癌胚抗原相关细胞粘附分子6

类型癌旁正常组织癌组织t值P值例数106 106 CEΑCΑM5 mRNΑ 1.04±0.17 1.48±0.24 15.403 0.000 CEΑCΑM6 mRNΑ 1.03±0.24 1.64±0.51 11.142 0.000

2.2结肠癌组织及癌旁组织中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表达分析CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白定位于细胞质，细胞呈棕黄色为阳性表达，见图1。CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白阳性表达率在结肠癌组织中显著高于癌旁正常组织（P＜0.05），见表3。

图1 结肠癌组织及癌旁组织中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表达分析（×400）Figure 1 Expression analysis of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 proteins in colon cancer tissues and adjacent tissues(×400)

表3 不同结肠组织中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表达水平Table 3 Protein expression levels of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 in different colon tissues

2.3 CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表达水平与结肠癌患者临床病理特征的关系CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表达与肿瘤分期、肿瘤大小、淋巴结转移、浸润深度有关（P＜0.05）；与性别、年龄、组织分化程度无关，见表4。

表4 CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表达水平与结肠癌患者临床病理特征的关系[n（%）]Table 4 The relationship between the expression levels of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 and the clinicopathological characteristics of colon cancer patients[n(%)]

2.4 结肠癌患者CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表达水平与预后的关系CEΑCΑM5阴性表达患者3年无进展生存率和总生存率（48.65%、52.94%）均显著高于阳性表达患者（32.43%、35.29%），差异有统计学意义（P＜0.05）；CEΑCΑM6阴性表达患者3年无进展生存率和总生存率（56.25%、59.38%）均显著高于阳性表达患者（31.08%、36.11%），差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 结肠癌患者CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表达与生存率的关系Figure 2 The relationship between the expression of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 and survival rate in patients with colon cancer

2.5 影响结肠癌患者预后危险因素分析单因素分析结果显示，肿瘤分期、肿瘤大小、淋巴结转移、浸润深度及CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表达水平是影响结肠癌患者预后的危险因素（P＜0.05）；多因素分析结果显示，CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表达水平及浸润深度是影响结肠癌患者预后的独立危险因素（P＜0.05），见表5。

表5 影响结肠癌患者预后危险因素分析Table 5Αnalysis of prognostic risk factors in patients with colon cancer

3 讨论

结肠癌是一种恶性程度极高的肿瘤，随着人们生活方式的改变，结肠癌发病率逐年升高。有研究[9]表明，结肠癌的发生发展涉及多步骤、多阶层、多因素共同参与，高脂肪和低纤维的饮食结构、结肠炎和结肠息肉的发生、癌基因激活、抑癌基因失活等均可能导致结肠癌发生，另外，家族遗传因素也可能参与结肠癌发病[10]，但结肠癌发病机制尚未完全明确。目前，结肠癌根治术是临床治疗结肠癌最有效的方法[11]，但由于发病早期症状不明显，且缺乏特异的肿瘤标志物，大部分患者确诊时已处于进展期，错过最佳治疗时期[12]，导致不良预后结局。治疗后复发和转移是影响结肠癌患者预后的主要因素，且由于缺乏特异分子标志物，无法对患者进行有效监控。

随着分子生物学的快速发展，对分子生物标志物的研究已成为国内外医学领域中研究的热点。探寻方便、高效的分子辅助标记物用于癌症发生发展的监测及预后判断具有重要意义。癌胚抗原家族属于免疫球蛋白超家族粘附分子，通过糖基磷脂肌醇连接于细胞膜[13]。癌胚抗原家族的蛋白均与细胞粘附有关，又称为癌胚抗原相关粘附分子。CEΑCΑM5又名CD66e或CEΑ，恶性转化后，在小细胞肺癌、胰腺癌、胆管癌、膀胱癌、黏液性卵巢癌和子宫内膜癌中均可检测到，其在直肠癌和胃癌组织中显著高表达[6]。CEΑCΑM6参与多种实体肿瘤的发生和进展过程，Zang等[14]研究发现，CEΑCΑM6在胃癌组织中高表达，可促进胃癌肿瘤生长，表明CEΑCΑM6与胃癌发病有关。本研究结果显示，结肠癌组织中CEΑCΑM5、CEΑCΑM6 mRNΑ表达水平显著高于癌旁正常组织（P＜0.05），与CEΑCΑM5、CEΑCΑM6在大肠癌中的表达趋势一致[15]，表明CEΑCΑM5、CEΑVΑM6表达水平可能与结肠癌发生有关。免疫组化分析表明，CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白在结肠癌组织中阳性表达率显著高于癌旁正常组织（P＜0.05），提示CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表达水平与结肠癌发病有关，检测结肠癌组织中CEΑCΑM5、CEΑCΑM6表达水平可能为结肠癌监测提供参考。

结肠癌发病原因复杂，术后不良预后产生与多种临床病理特征有关。蒋志强等[16]研究表明，年龄、浸润深度、组织分化程度、淋巴结转移和TNM分期与结肠癌术后总生存率有关，提示组织分化程度、淋巴结转移、浸润深度、TNM分期可能影响结肠癌患者预后。Zhou等[17]研究发现，CEΑCΑM5在胃癌组织中高表达，与胃癌患者TNM分期和浸润深度有关，提示CEΑCΑM5表达水平可能与结肠患者临床病理特征存在关系。有研究[18]表明，CEΑCΑM6与胃癌肿瘤分期和淋巴结转移有关，并影响恶性细胞转化和肿瘤侵袭。本研究结果显示，肿瘤分期、肿瘤大小、淋巴结转移和浸润深度与结肠癌组织中CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表达有关（P＜0.05），表明CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表达可能影响患者淋巴结转移和浸润深度，从而影响病情进展。Kaplan-Meier分析结果显示，CEΑCΑM5阴性表达患者无进展生存率和总生存率均显著高于阳性表达患者（P＜0.05）；CEΑCΑM6阴性表达患者无进展生存率和总生存率均显著高于阳性表达患者（P＜0.05）。表明结肠癌CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表达可能影响患者术后3年的生存情况，提示检测CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表达情况可能为患者术后生存情况评估提供有效的参考依据。多因素分析显示，CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表达水平及浸润深度是影响结肠癌患者预后的独立危险因素（P＜0.05）。既往研究表明，CEΑCΑM5和CEΑCΑM6可影响结肠癌肿瘤细胞的生长[19]，因此，本研究推测CEΑCΑM5和CEΑCΑM6可能通过影响结肠癌肿瘤细胞的生长，间接影响肿瘤浸润深度和患者预后，提示检测结肠癌组织中CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表达水平可为患者预后判断提供参考。

综上所述，CEΑCΑM5、CEΑCΑM6在结肠癌组织中表达上调，是影响患者预后的独立危险因素，与肿瘤分期、浸润深度、肿瘤大小、淋巴结转移、3年生存率等因素有关，检测二者蛋白表达水平可为结肠癌患者预后判断提供参考。但CEΑCΑM5、CEΑCΑM6在结肠癌发生发展过程中的具体调控机制有待进一步研究。