安松林 马 玲 赵 月 李 雁*

(1.首都医科大学附属北京世纪坛医院肿瘤外科，北京 100038; 2. 北京电力医院普通外科，北京 100073)

主要促进因子超家族蛋白2A(major facilitator superfamily domain containing 2A，MFSD2A)是一种膜蛋白，于2008年被Angers确认为主要促进因子超家族(major facilitator superfamily，MFS)的新成员[1]。MFSD2A在胚胎发育、脂代谢、炎症、再生和血-脑脊液屏障中均具有重要作用[2]。肿瘤相关的研究[3]显示，MFSD2A在肺癌中发挥抑癌基因的功能，但MFSD2A在肝细胞肝癌中的研究尚未见报道。本研究通过构建慢病毒载体转染肝癌细胞，干扰MFSD2A在肝癌细胞中的表达，探索其对细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系

肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721从美国模式培养集存库(American Type Culture Collection，ATCC)购得。

1.1.2 主要试剂

DMEM培养基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自美国Gibco公司，Plv-EGFP载体购自中国赛亚生物科技有限公司，感受态细胞Stbl3和切胶回收试剂盒购自中国康为世纪生物科技有限公司，限制性内切和T4 DNA连接酶和SYBR Premix Ex Taq购自日本Takara公司；单克隆片段重组酶试剂盒购自中国南京诺唯赞生物科技有限公司，抗-MFSD2A抗体(ab105399)购自英国Abcam公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自日本Dojindo公司，PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I购自美国BD Pharmingen公司，Transwell小室及Matrigel基质胶购自美国Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721均由DMEM培养液混合10%(体积分数)FBS，100 μg/mL 链霉素和100 U/mL青霉素在37 ℃、5%(体积分数) CO2细胞培养箱中培养。

1.2.2 构建稳定高表达MFSD2A的肝癌细胞株

根据MFSD2A基因[美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI) Reference Sequence: NM_001136493.2]序列分析的结果及质粒上基因的插入位点，分别进行DNA的设计及合成；线性化Plv-EGFP载体；切胶回收线性化载体并检测浓度；通过同源重组的方式将合成的DNA片段连接到线性化载体上；提取质粒，测序验证重组克隆中插入序列是否与要求一致。……