许倩云，崔昊晶

(内蒙古医科大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科，内蒙古 呼和浩特 010050)

分泌性中耳炎是耳鼻咽喉科较常见的炎性疾病，其主要由功能性通气功能障碍、机械性阻塞造成，临床表现为鼓室积液、听力下降等[1-2]。分泌性中耳炎多见于儿童，是造成儿童听力下降的最主要因素，且病情复杂，易反复发作，临床治愈困难[3]。因此，探究分泌性中耳炎的发病机制具有重要临床意义。高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box-1，HMGB1)是一种非组蛋白核蛋白，其可参与DNA重组、转录调节等，并可作为炎症因子在多种炎症性疾病中发挥重要作用[4]。Toll样受体2(toll-like receptor 2，TLR2)是一种天然的免疫特异性病原识别受体，在维持中耳功能等方面发挥重要作用[5]。然而，关于血清HMGB1、TLR2对分泌性中耳炎的影响目前尚不完全清楚。鉴于此，本研究拟通过检测分泌性中耳炎患者血清中HMGB1、TLR2的表达情况，探究其在分泌性中耳炎中的作用，以期为临床提供一定参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2018年9月至2020年7月我院收治的分泌性中耳炎患者140例作为分泌性中耳炎组，其中男81例，女59例，年龄7～15岁，并根据病情严重程度[6]将其分为急性组(63例)和慢性组(77例)。选取同期在我院体检中心进行体检的100名健康人员作为对照组，其中男52例，女48例，年龄6～15岁。分泌性中耳炎组和对照组的性别、年龄比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

分泌性中耳炎组纳入标准：①符合分泌性中耳炎的相关诊断标准[6]；②无分泌性中耳炎家族史；③临床资料完整。排除标准：①患有甲状腺、糖尿病等其他内分泌疾病；②有过敏性鼻炎等病史；③患有免疫系统疾病。本研究经本院医学伦理委员会批准通过(NO.201805-7)，且符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》，所有患者及家属自愿参加本研究，并签署知情同意书。

1.2 主要仪器和试剂

离心机(型号：RJ-TDL-60A)购自无锡市瑞江分析仪器有限公司；酶标仪(型号：Phomo)购自郑州安图生物工程股份有限公司；人HMGB1酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(批号：20171205)购自上海钰博生物科技有限公司；人降钙素原(procalcitonin，PCT)ELISA试剂盒(批号：20180103)购自上海晶风生物科技有限公司；人肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)ELISA试剂盒(批号：20171028，20180209)均购自上海心语生物科技有限公司，逆转录试剂盒(批号：20180322)购自杭州联科美讯生物医药技术有限公司；总RNA提取试剂盒(批号：20180419)购自北京艾德莱生物科技有限公司；实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)仪(型号：StepOne TM)购自美国应用生物系统公司；血清TLR2 mRNA及内参GAPDH引物由苏州鸿讯生物科技股份有限公司合成；其他化学药品均购自天津永大化学试剂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集及保存 于清晨采集所有研究对象空腹状态下静脉血5 mL，以3 000 r/min的速度离心10 min，分层后收集上层血清，然后置于-80 ℃冰箱中保存待测。

1.3.2 ELISA法检测血清HMGB1、PCT、TNF-α、IL-6表达水平 将上述血清样品解冻，然后稀释标准样品，在标准孔、空白孔及待测样品的包被板中分别加样，将其完全溶解并充分混合均匀，37 ℃条件下温育30 min；用PBST洗涤液洗涤后拍干，加入50 μL酶标试剂温育30 min，然后加入终止液至反应停止，最后使用酶标仪进行测定。

1.3.3 qRT-PCR法检测血清TLR2 mRNA表达水平 取上述保存的待测血清，使用总RNA提取试剂盒提取总RNA，逆转录得到cDNA。再以逆转录合成的cDNA为模板，进行qRT-PCR检测。PCR反应条件为：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s；60 ℃，25 s；72 ℃，20 s，共40个循环。血清TLR2 mRNA及内参GAPDH的引物序列见表1。采用2-ΔΔCT法计算血清TLR2 mRNA相对表达量。

表1 引物序列

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 炎症因子水平比较

分泌性中耳炎组血清炎症因子PCT、TNF-α、IL-6表达水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 炎症因子表达水平比较

2.2 血清HMGB1、TLR2 mRNA表达水平比较

分泌性中耳炎组血清HMGB1、TLR2 mRNA表达水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。急性组血清HMGB1、TLR2 mRNA表达水平均高于慢性组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表3 分泌性中耳炎组和对照组血清HMGB1、TLR2 mRNA表达水平

表4 急性组和慢性组血清HMGB1、TLR2 mRNA表达水平

2.3 血清HMGB1与TLR2 mRNA表达水平的相关性

Pearson法分析结果显示，分泌性中耳炎患者血清HMGB1与TLR2 mRNA表达水平呈正相关(r=0.503，P<0.001)，见图1。

图1 血清HMGB1与TLR2 mRNA表达水平的相关性

2.4 血清HMGB1、TLR2 mRNA表达水平与炎症因子的相关性

Pearson法分析结果显示，分泌性中耳炎患者血清HMGB1、TLR2 mRNA表达水平与炎症因子PCT、TNF-α、IL-6均呈正相关(P<0.05)，见表5。

表5 血清HMGB1、TLR2 mRNA表达水平与炎症因子的相关性分析

2.5 影响分泌性中耳炎发生的危险因素分析

以是否发生分泌性中耳炎为因变量(0=否，1=是)，以分泌性中耳炎组和对照组有统计学差异的指标(血清PCT、TNF-α、IL-6、HMGB1、TLR2 mRNA表达水平)为自变量。PCT、TNF-α、IL-6、HMGB1、TLR2 mRNA分别以各自的平均值为界进行分组：PCT高表达(≥4.18 ng·mL-1)和低表达(<4.18 ng·mL-1)，TNF-α高表达(≥2.43 ng·mL-1)和低表达(<2.43 ng·mL-1)，IL-6高表达(≥6.57 pg·L-1)和低表达(<6.57 pg·L-1)，HMGB1高表达(≥83.92 μg·L-1)和低表达(<83.92 μg·L-1)，TLR2 mRNA高表达(≥1.35)和低表达(<1.35)，以上各指标赋值均为0=低表达，1=高表达。Logistic回归分析结果显示：血清HMGB1、TLR2 mRNA高表达是分泌性中耳炎发生的危险因素(P<0.05)，见表6。

3 讨论

分泌性中耳炎在中耳炎中较为常见，主要分为急性分泌性中耳炎和慢性分泌性中耳炎，其发病与感染、免疫反应、咽鼓管功能异常、炎症反应等密切相关[7-9]。流行病学研究显示，约25%的学龄儿童患有分泌性中耳炎，且经治疗后易复发，严重影响患儿的身心健康[10]。因此，对分泌性中耳炎的发病机制进行研究，寻找与该病相关的标志物具有一定临床意义。

HMGB1是高迁移率族蛋白家族的成员之一，广泛分布在细胞质及细胞核中，可与DNA结合，在DNA重组、转录等过程中发挥重要作用，也可与细胞膜表面受体结合，激活NF-κB通路，促进免疫应答的发生[11-12]。王丹等[13]研究发现，HMGB1在支原体感染盆腔炎患者的血清中呈高表达，其表达水平可为支原体感染盆腔炎患者的病情评估及诊断提供参考依据。分泌性中耳炎是一种炎症性疾病，其病情严重程度与炎症因子水平变化有关。更藏达杰等[14]研究发现，分泌性中耳炎患者血清中炎症因子PCT、TNF-α表达水平升高，表明二者异常升高与该病的发展有关。本研究结果显示，分泌性中耳炎组患者血清HMGB1表达水平显著高于对照组，急性组患者血清HMGB1表达水平显著高于慢性组，且其表达水平与炎症因子PCT、TNF-α、IL-6均呈正相关，提示血清HMGB1可能参与分泌性中耳炎的发生发展。

TLR2是Toll样受体家族的重要成员，也是机体内的一种天然免疫类蛋白分子，其可识别机体内多种微生物的相关分子结构，并在机体免疫应答、炎症反应等方面发挥重要作用[15-16]。戚明等[17]研究发现，TLR2在结核性胸膜炎患者胸腔积液中呈高表达，其诊断结核性胸膜炎的AUC为0.774，且与肿瘤坏死因子、TLR4呈正相关，推测其可作为诊断结核性胸膜炎的潜在生物学指标。Huang等[18]研究发现，TLR2信号传导能够清除细菌，及时减轻肺炎链球菌诱发的中耳炎炎症反应。本研究结果显示，分泌性中耳炎组血清TLR2 mRNA表达水平显著高于对照组，急性组血清TLR2 mRNA表达水平显著高于慢性组，且其表达水平与炎症因子PCT、TNF-α、IL-6均呈正相关，提示血清TLR2 mRNA可能参与分泌性中耳炎的发生发展。

潘红梅等[19]的研究显示，HMGB1在狼疮肾炎中呈高表达，且可能通过靶向激活TLR/NF-κB通路发挥作用。本研究结果显示，分泌性中耳炎患者血清HMGB1与TLR2 mRNA表达水平呈正相关，进一步提示血清HMGB1与TLR2 mRNA可能共同在分泌性中耳炎发病过程中发挥作用，但其具体机制仍有待进一步证实。此外，本研究Logistic回归分析结果显示，血清HMGB1、TLR2 mRNA高表达是分泌性中耳炎发生的危险因素，提示监测二者表达水平，对评估分泌性中耳炎的发生有一定的临床意义。

综上所述，HMGB1、TLR2 mRNA在分泌性中耳炎患者血清中的表达水平明显较高，提示二者与分泌性中耳炎的发生发展密切相关，可作为分泌性中耳炎病情评估的潜在生物学指标。但分泌性中耳炎的发生受多种因素影响，因此仍需寻找更多影响分泌性中耳炎发生的相关因素，为其临床预防及治疗提供一定的参考。