李祥，瞿颖东，寇晓旺，旷昕*

（1.南方医科大学附属龙华区人民医院，广东 深圳 518000；2.南华大学附属第一医院，湖南 衡阳 421001）

0 引言

2019 年12 月，新型冠状病毒肺炎（简称“新冠肺炎”；novelcoronaviruspneumonia，NCP）在世界蔓延，严重威胁人类健康[1]。由于确诊及死亡例数迅速增加，部分医务人员和公众出现了抑郁等心理问题，尤其是与患者直接接触、战斗在抗击疫情一线的医务人员[2]。抑郁症是一种精神心理疾病的临床症状。研究表明，诱发因素包括遗传因素、慢性病、心理环境、社会环境因素等。其中，遗传基因决定了抑郁症的易感性，而环境因素是抑郁症的诱发因素[3]。目前抗抑郁症仍以西医为主，但西医治疗目标单一，存在抗抑郁药谱窄、疗效慢、副作用大等弊端。中药具有成分多、副作用小、疗效好、协同作用强、整体调节性强等特点，在抑郁症的治疗中发挥着独特的作用。湖南著名中医专家李聪甫、刘炳凡、欧阳锜在1985 年马王堆汉墓出土的古代中医书籍的基础上，结合人参、黄芪、淫羊藿、黄精、枸杞子、菟丝子、女贞子等药材，提出了马王堆养生的文化思想[4]。古语曰：“天有三宝日、月、星；地有三宝水、火、风；人有三宝精、气、神。[5]”在秦朝以前，精气神一直被视为人体存在的基础，因此认为：“精脱者死、气脱者死、失神者死”[6]。因此古汉养生精也可改善抑郁症等精神疾病。中医药的作用机制往往是多种成分、途径和靶点的相互作用，但传统的研究方法很难从这一层面研究古汉养生精的作用机制。系统药学作为一门新兴的科学，打破了“一药一靶一病”的传统思维模式和框架[7]。结合系统生物学、多方位药理学、计算生物学、网络分析等学科的技术手段和内容，构建了一个从整体角度探讨药物与疾病关系的多层次网络，该网络是非常系统和整体的，与中医治病的整体观和辨证论治的原则相符[8]。在此基础上，本文将通过网络药理学分析和预测古汉养生精改善疫情期间医务人员抑郁症的生物学机制。

1 资料与方法

1.1 古汉养生精的化学成分数据库的构建

中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Databaseand Analysis Platform，TCMSP）（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）是 中 药 材化学成分及靶点的数据库，在Herbname 中分别输入“淫羊藿”“枸杞”“女贞子”“菟丝子”“金樱子”“白芍”“人参”“黄芪”“黄精”“麦芽”“甘草”等11 个中药获取古汉养生精化学成分及靶点。

1.2 筛选活性化合物

口服生物利用度（oral availability，OB）是药代动力学中药物吸收、分布、代谢和排泄过程中最重要的参数，口服药物生物利用度是衡量生物活性分子( 即有效分子) 药代动力学的关键指标，它是指口服药物到达体循环占口服剂量的比例[9]。为了排除古汉养生精中成药性低的化合物，用类药性（drug likeness，DL）评估指数来优化化合物的药效学和药动学性质，例如水溶性和化学稳定性[10]。药物半衰期（Half-life evaluation of drugs，DHL）是指“化合物在体内减至初始值的一半所需的时间”，这是化合物产生疗效时间的最重要属性[11]。中药大部分是通过口服，穿过小肠黏膜上皮屏障，进入体内。肠上皮细胞（Intestinal absorption model，Caco-2）决定药物进入人体的速度和程度，最终影响中药生物利用度[12]。因此，本文以口服生物利用度阈值OB ≥35%、类药性阈值DL ≥0.18、药物半衰期阈值DHL ≥4h、肠吸收阈值Caco-2 ≥0.2 作为活性化合物筛选的条件，筛选出古汉养生精中活性高的化合物，以提高数据分析和处理的价值。

1.3 构建化合物-靶点-疾病

网络将古汉养生精活性化合物和疾病相关靶点通过Cytoscape3.7.2 软件构建出化合物-靶点网络，通过软件自带工具可视化分析，以推测古汉养生精可能的药理作用机制原理，并以靶点度值（Degree）和中介中心度（betweeness centrality）两个重要指标评价古汉养生精中活性化合物及靶点。

1.4 构建蛋白互作网络(protein protein interaction network，PPI network)

蛋白质相互作用是指参与同一细胞的生物化学过程的蛋白质必须通过相互作用组成大分子化合物才能完成其生物学过程或功能。因此，蛋白质相互作用网络有助于分析蛋白质在生物过程中的功能。将筛选出的古汉养生精靶点基因传入STRING 网站（https://string-db.org/），为保证筛选条件的高置信度，本文设置评分条件参数>0.90，去除图中单独的蛋白质，最后输出蛋白互作网络PPI 图，进行可视化研究分析，并根据结果计算靶点基因关联频次。

1.5 GO 功能富集分析、KEGG 通路富集分析GO 功能富集分析包含了三个重要的功能信息

基因参与的生物过程、基因所处的细胞位置、基因发挥的分子功能。KEGG 通路富集分析是由日本开发的基因数据分析数据库，并且该数据库关联到David 数据库，可进行通路查询。为了阐明古汉养生精的靶蛋白在信号通路中的作用，先将靶蛋白通过Uniprot 网站进行基因代码转换，再通过R 语言中David6.8 数据库函数对相关基因进行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，以了解古汉养生精改善抑郁症的相关机制。

2 结果

2.1 古汉养生精化合物筛选表

古汉养生精活性化合物的筛选古汉养生精中化合物共有1258 种。 以OB ≥35%、DL ≥0.18、DHL ≥4h、Caco-2 ≥0.2 作为筛选条件，选取活性化合物共166 种。除去重复后共126 种。见表1。

表1 古汉养生精化合物筛选表

2.2 古汉养生精化合物-靶点

相互作用网络对化合物及靶点数据进行相关处理后，通过Cytoscape 3.7.2 构图后得到化合物- 靶标网络（见图1）。在该网络中共有节点288 个。Degree 代表网络中与节点相连的路线的数目，节点大小与Degree 正相关。软件自带拓扑学工具分析结果如下：网络集中度：0.531；网络密度：0.040；网络异质性：1.524；最短路径：72092（100%）。网络中有269 个节点( 其中中药化合物节点115 个，靶基因节点151 个)，见图1。度值最高者分别为山奈酚（kaempferol）、β- 谷甾醇（beta-sitosterol）、异鼠李素（isorhamnetin）、豆甾醇（Stigmasterol）、芒柄花素（formononetin），这些度值较高的化合物可能是古汉养生精改善抑郁症的关键化合物，见表2。

表2 度值前5 位的化合物

2.3 古汉养生精PPI 网络的构建与分析

基于蛋白质相互作用原理推测古汉养生精治疗抑郁症的机制，本文通过STRING 网站构建了古汉养生精靶标的PPI 网络图（见图2）。选择置信度>0.90，去除独立的靶标蛋白。通过网站生成的PPI 网络有152 个节点，494 条边，平均Degree 为6.5，图2 中节点表示靶标蛋白，每条边代表靶标蛋白之间的相互作用关系。选取Degree 值较高的30 个关键靶标蛋白绘制出条形图（见图3）。其中JUN 度值（Degree=28）最高，在PPI 网络中有重要作用。

图2 古汉养生精靶蛋白PPI 网络图

图3 蛋白质信息条形图

2.4 GO 功能富集分析、KEGG 通路富集分析

使用R 语言中关于DAVID 数据库函数对古汉养生精靶蛋白基因进行GO 富集分析和KEGG 通路富集，结果分别有150 富集结果和164 富集结果，使用Bonferroni 算法进行调整，得到各条富集通路的P值（P<0.01 是显著富集，P值越小代表富集越显著），根据P值排序列举前20 个通路进行分析，见表3、4。

表3 前20 位GO 通路富集表

表4 前20 位KEGG 通路富集表

3 讨论

目前，随着社会对疫情关注，对医务人员身心健康也逐步重视。但抑郁症发病机制还不完全明确，有学者对近年来抑郁症机制的研究进行了总结：γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、去甲肾上腺素(nor-epinephrine，NE)及多巴胺等都是脑内最重要的神经递质，研究发现其功能紊乱与抑郁症发病关系密切[13]。另外神经免疫通路的激活和抑郁的关系近年来受到关注[14]。现基于已有研究文献，结合上述研究推演古汉养生精改善抑郁症的机制。

古汉养生精中活性化合物共166 种，与抑郁症相关的靶基因152 个。根据化合物- 靶点相互作用网络分析，黄酮类化合物在度值和中介中心度都高于平均值以上的化合物中，推测是古汉养生精的核心成分，如kaempferol、betasitosterol、isorhamnetin、formononetin、Stigmasterol 等。黄酮类化合物在自然界的植物中广泛存在，属于植物生成产物。黄酮类化合物具有多方面药用价值，比如预防和治疗心脑血管疾病、镇咳、排痰、缓解哮喘和杀菌，以及保护肝脏、排毒、治疗多种肝炎、改善肝硬化、抑制氧自由基生成和抗氧化作用[15]。黄酮类化合物在神经系统中的药理作用逐渐被重视，国内外学者均发现，黄酮类化合物具有改善抑郁、解除焦虑、缓解中枢神经抑制、治疗精神分裂症、保护神经系统、缓解疼痛、改善学习记忆、影响神经内分泌等多种功能，但其通过多种受体和信号通路，作用机制非常复杂[16-17]。在这些研究中，一些黄酮类化合物被发现具有与抑郁症发病机制相同的作用靶点，推测古汉养生精可能是通过这些靶点改善抑郁症。黄酮类化合物kaempferol 是古汉养生精的主要活性成分，其中度值与中介中心度远超过过其他化合物。kaempferol 有预防癌症发生、抗肿瘤细胞生长、减轻炎症、抗氧化、杀菌、抗病毒等多种功能而受到研究者的广泛关注[18]。现有研究发现在CUMS 抑郁症模型大鼠中，使用kaempferol 能通过抑制自噬和氧化应激减轻海马神经元的损伤[19]。蒲公英在小鼠抑郁模型中的抗抑郁作用是由于皮质酮水平的抑制和丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1（MKP-1）和脑源性神经营养因子（BDNF）表达的调节[20]。因此，推测kaempferol 可能通过抑制自噬、减轻氧化应激、调节BDNF 等途径改善抑郁症。在靶标蛋白互作中，c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)属于丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族中受应激激活的一类激酶.众多研究表明,在神经萎缩、炎症反应、氧化应激、心理应激事件中均显著涉及JNK 的激活,而这些事件均与抑郁症紧密相联.近年来运用基因敲除和JNK 抑制剂等手段证明JNK 的确参与抑郁症状的调控;同时不少抗抑郁药的疗效涉及对JNK 活性的调节,这些已初步确立JNK与抑郁症之间的关联[21]。淀粉样蛋白前体蛋白（APP）基因表达的淀粉样蛋白前体蛋白通过分泌酶水解，生成了具有神经毒性的β 淀粉样蛋白肽和蛋白沉淀，这是阿尔茨海默病的重要病理因素之一，但APP/PS1 双转基因小鼠在情绪上表现出了抑郁样行为[22]。在肿瘤、糖尿病以及精神分裂症等疾病中可以见到AKT 信号通路调节异常。在肿瘤突变中，过度激活这条通路可引起细胞变化，从而导致肿瘤的发生。但在精神方面疾病中，由于抑制这条通路使中枢神经元和海马干细胞功能发生下降，继而导致精神异常[23]。

结 果 表 明，GO 的 富 集 途 径 有150 条，KEGG 的 富 集途径有164 条，主要是通过AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Th17 cell differentiation、HIF-1 signaling pathway 等关键信号通路发挥有效的治疗作用。晚期糖基化终产物（AGEs）是一种由还原糖的醛基与体内多种蛋白质的脂蛋白、氨基组、脂质等发生氧化反应以及非酶糖基化反应的终产物，可以与自身，也可以与晚期糖基化终产物受体（RAGE）结合，继而诱导氧化应激，激活相应的信号通路，诱导一系列促炎症和促凝血反应[24]。AGE/RAGE 信号可激活包括NADPH 氧化酶、蛋白激酶C 和MAPKs 在内的多种细胞内信号通路，导致NF-κB 激活。抑郁症患者血清中NFκB、TNF-α、IL-8 水平升高提示炎症反应参与了抑郁症的发病机制[25]。在电针抗抑郁实验中，发现通过下调RAGE 的表达，可以发挥抗神经损伤作用，改善抑郁[26]。淫羊藿苷Ⅱ可下调APP/PS1 转基因小鼠海马内的APP、Aβ1-42、RAGE 蛋白水平，抑制炎症[27]。人参皂甙RG3 能抑制创面皮肤AGEs 的沉积，调节高氧化应激状态[28]。TH17 细胞在包括自身免疫组织损伤在内的炎症反应中起着重要作用，主要分泌IL-17A、IL-22 和TNF-α 等[29]。TH17 细 胞 分 泌 的IL-17A 和IL-22可通过血脑屏障，诱导免疫细胞和促炎细胞因子进入脑内或激活小胶质细胞和星形胶质细胞，影响中枢神经系统稳态，引起或加重脑内炎症[30]。研究人员还发现，TH17 细胞在小肠中的分布更为广泛，可以被肠道微生物群调节，这一发现支持了抑郁症发病机制的脑-肠轴假说，也就是说，应激引起的肠道微生物群破坏导致TH17 细胞增多，产生大量IL-17A 进入大脑触发炎症反应，导致神经损伤和抑郁[31]。古汉养生精组方中淫羊藿和枸杞均能维持Tregs 和TH17 的功能平衡，改善器官免疫损伤[32-33]。

为了探讨古汉养生精改善疫情期间医务人员抑郁症的机理，运用系统网络药理学方法，构建了“化合物-靶标-通路”生物信息学网络。我们结合数据模型，预测了古汉养生精的主要活性成分、核心靶点和关键途径，在分析大量文献资料的基础上，提出了古汉养生精改善抑郁症的多成分、多靶点、多途径作用机制，提示了其改善抑郁症的机制，希望为改善疫情期间医务人员身心健康提供一些理论依据。同时本研究也具有一定的局限性，希望进一步通过实验验证。