夏秀丽，赵树山，宋晓明，李云，徐珊，程丽敏，徐超

1邯郸市中心医院消化内科，河北邯郸 056001；2邯郸市中心医院普外科；3邯郸市中心医院病理科

食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一。我国是食管癌的高发国家，据统计，我国每年新发食管癌病例超过25万例，每年因食管癌死亡的患者约20.6万例[1]。食管癌主要分为鳞癌和腺癌两种组织类型，其中鳞状细胞癌占全部食管癌的90%以上[2]。近年来，随着诊疗技术的不断发展，多数食管癌患者可得到有效治疗，但患者的远期预后仍有待提高。微小RNA(miR)是一类内源性非编码的小RNA分子，可与信使RNA的3′开放区互补结合，起到调控基因转录的作用。研究证实，miR在肿瘤发生发展中发挥重要作用[3]。miR-145、miR-765均与肿瘤发生有关。有研究报道，miR-145可抑制胃癌细胞的迁移、侵袭[4]；miR-765则可促进乳腺癌的发生发展[5]。因此推测，miR-145、miR-765可能与食管鳞状细胞癌细胞增殖和患者预后密切有关。2015年1月—2017年12月,我们探讨了食管鳞状细胞癌组织中miR-145、miR-765表达变化及意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年1月—2017年12月我院收治的食管鳞状细胞癌患者80例。纳入标准：①符合美国国立综合癌症网络制定的食管癌诊断标准[6]，并经手术切除后病理诊断为食管鳞状细胞癌；②患者第一次罹患恶性肿瘤，本次治疗为初次就诊，且手术前未经其他抗肿瘤治疗；③患者临床资料完整，均择期完成手术且保留癌组织和癌旁组织标本；④患者或其家属对本研究知情同意。排除标准：①同时发现其他器官、系统发生恶性肿瘤者；②疾病严重，预计生存期<6个月者；③近6个月内发生感染性疾病者；④合并内分泌系统、免疫系统疾病者；⑤不具备手术指征者。80例患者中男49例、女31例，年龄44～80(61.37±8.42)岁；组织分化程度：低分化13例、中分化19例、高分化48例；TNM分期：Ⅰ期12例、Ⅱ期32例、Ⅲ期36例。本研究经医院伦理委员会批准(LS-HDZX201412)。

1.2 食管鳞状细胞癌组织与癌旁组织中miR-145、miR-765表达检测 采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法。取患者术中切取的癌组织及癌旁组织标本，并将标本冰上研磨，TRIzol法提取组织总RNA，再经分光光度计测量光密度值后进行反转录，生成总cDNA，应用TaqMan MicroRNA assay试剂盒进行扩增反应。引物序列由苏州吉玛生物科技有限公司合成。miR-145正向引物5′-GTCCAGTTTTCCCAGGAAT-3′，反向引物5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；miR-765正向引物5′-GCCTGGAGGAGAAGGAA-3′，反向引物5′-GTGGAGGGTCCGAGGT-3′；U6正向引物5′-ATGGACTATCATATGCTTACCGTA-3′，反向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCAC-3′。反应体系：cDNA 1 μL，PCR primer 0.5 μL，2 Master 10 μL，20 SYBRI 1 μL，H2O 7.5 μL，共计20 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，55 ℃延伸20 s，共计40个循环。以U6为内参，通过2-ΔΔCt法计算miR-145、miR-765相对表达量，进行3次平行试验，取其平均值。

1.3 食管鳞状细胞癌组织与癌旁组织中增殖指数(PI)测算 采用免疫组化法。将癌组织和癌旁组织标本按7点法取材，浸入10%中性甲醛中固定，常规石蜡包埋，制成连续切片，采用SABC免疫组化法染色，常规二甲苯脱蜡后分别浸入梯度乙醇中进行水化，PBS缓冲液冲洗，高温高压抗原修复，消化内源性过氧化物酶，滴加山羊血清封闭抗原，加入兔抗人增殖细胞核抗原单克隆抗体，饱和湿度过夜，加入生物学二抗，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封片，显微镜下观察。以PBS代替生物学一抗作为阴性对照，以试剂盒配套的阳性图片做为阳性对照。阳性表达位于细胞核呈黄色或棕褐色颗粒，400倍显微镜下计数1 000个细胞，计算阳性细胞百分数作为PI[7]。

1.4 食管鳞状细胞癌组织与癌旁组织中凋亡指数(AI)测算 采用TUNEL法。制片方法同上，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，PBS缓冲液冲洗，滴加不含DNase的蛋白酶K 20 μg/mL，常温下反应15～30 min，PBS冲洗，制备并滴加TUNEL反应混合液，滴加PBS荧光显微镜下计数，滴加converter-POD，反应30 min，PBS冲洗，加入DAB反应，PBS冲洗，苏木精复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封片，显微镜下观察。阳性表达位于细胞核呈黄色或棕褐色颗粒，400倍显微镜下计数1 000个细胞，计算阳性细胞百分数作为AI[8]。

1.5 随访及预后观察 所有患者通过门诊复查或电话随访，随访时间为36个月，根据食管鳞状细胞癌组织中miR-145、miR-765表达的均值将患者分为miR-145高表达组、miR-145低表达组；miR-765高表达组、miR-765低表达组，比较各组生存状况。

2 结果

2.1 食管鳞状细胞癌组织与癌旁组织中miR-145、miR-765表达比较 食管鳞状细胞癌与癌旁组织中miR-145相对表达量分别为0.943±0.178、3.598±0.443，miR-765相对表达量分别为3.836±0.502、1.201±0.282，食管鳞状细胞癌组织与癌旁组织中miR-145、miR-765表达比较，P均<0.05。

2.2 食管鳞状细胞癌组织与癌旁组织中PI、AI比较 食管鳞状细胞癌与癌旁组织中PI分别为(32.07±4.28)%、(16.75±2.75)%，AI分别为(2.88±0.72)%、(13.89±2.37)%，食管鳞状细胞癌组织与癌旁组织中PI、AI比较，P均<0.05。

2.3 食管鳞状细胞癌组织中miR-145、miR-765表达与PI 、AI的相关性 Pearson相关分析显示，食管鳞状细胞癌组织中miR-145表达与PI呈负相关(r=-0.522，P<0.05)，与AI呈正相关(r=0.578，P<0.05)；miR-765表达与PI呈正相关(r=0.602，P<0.05)，与AI呈负相关(r=-0.511，P<0.05)。

2.4 食管鳞状细胞癌组织中miR-145、miR-765表达与患者临床病理特征的关系 中低分化、TNM分期Ⅲ期患者miR-145表达低于高分化、TNM分期Ⅰ期+Ⅱ期患者(P均<0.05)，miR-765表达高于高分化、TNM 分期Ⅰ期+Ⅱ期患者(P均<0.05)。不同性别、年龄、肿瘤直径的食管鳞状细胞癌患者癌组织中miR-14、miR-765表达比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表1。

表1 食管癌组织中miR-145、miR-765表达与患者临床病理特征的关系

2.5 食管鳞状细胞癌组织中miR-145、miR-765表达与患者预后的关系 80例患者完成36个月随访，失访4例，予以剔除，失访率5.00%。至随访结束存活48例，死亡28例，miR-145高表达组、miR-145低表达组生存率分别为82.35%(28/34)、47.62%(20/42)；miR-765高表达组、miR-765低表达组生存率分别为48.65%(18/37)、76.92%(30/39)；经Log-rank检验发现，miR-145高表达组生存率高于miR-145低表达组，miR-765低表达组生存率高于miR-765高表达组(χ2分别为9.742、6.523，P均<0.05)。

2.6 食管鳞状细胞癌患者死亡的危险因素分析 以食管鳞状细胞癌患者为样本，患者是否死亡为因变量，以性别、年龄、肿瘤直径、组织分化程度、TNM分期、miR-145表达、miR-765表达为自变量，建立Cox比例风险回归分析模型，结果显示组织中低分化、TNM分期Ⅲ期、miR-145低表达、miR-765高表达是食管鳞状细胞癌患者死亡的危险因素(P均<0.05)，见表2。

表2 食管鳞状细胞癌患者死亡危险因素的Cox比例风险回归分析

3 讨论

食管鳞状细胞癌是食管癌的主要组织类型，该病病因和发病机制复杂，目前仍未完全明确。从临床治疗情况来看，由于食管鳞状细胞癌早期症状体征不明显，多数患者就诊时已处于中晚期，不仅增加了治疗难度，还能影响患者预后和生存质量。食管鳞状细胞癌的发生发展是多步骤、多基因参与的长期过程，涉及到众多基因的异常表达。miR是一类长度在20个核苷酸左右的内源性非编码小RNA分子，其数量众多[9]。研究表明，miR广泛参与机体生理功能和疾病的发生，尤其是在肿瘤的发生发展中扮演重要角色，在肿瘤的诊断、治疗和预后判断中有一定的应用潜力[10]。

miR-145定位于染色体5q32-33，是一类广泛存在于机体各类组织的miR[11]。研究表明，miR-145在膀胱癌组织中呈低表达，可作为抑癌基因参与肿瘤的生长、浸润和转移等过程[12]。张月宁等[13]报道，miR-145可抑制基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表达，进而抑制卵巢癌细胞增殖和迁移，促进其凋亡。邴钟兴等[14]报道，miR-145可在通过体外调节途径抑制食管鳞状细胞癌细胞增殖。miR-765定位于染色体1q23.1，具有促进细胞增殖的功能[15]。已有报道显示，在乳腺癌组织中miR-765呈异常高表达[16]。本研究结果显示，在食管鳞状细胞癌组织中存在miR-145异常低表达和miR-765异常高表达，表明miR-145、miR-765与食管鳞状细胞癌的发生发展密切相关。众所周知，肿瘤的发生是细胞异常增殖的结果，肿瘤的发生与细胞PI增高和AI降低密切相关。而本研究中食管鳞状细胞癌组织中miR-145表达与PI呈负相关，与AI呈正相关；miR-765表达与PI呈正相关，与AI呈负相关。提示miR-145、miR-765可以通过调控细胞增殖和凋亡影响食管鳞状细胞癌的发生发展。

进一步分析发现，miR-145、miR-765表达与食管鳞状细胞癌组织分化程度、TNM分期有关。这可能是因为miR-145的降低导致MMP-2、MMP-9水平升高，进而增强癌细胞的侵袭能力和转移能力[13]。miR-145低表达和miR-765高表达还可能增强食管鳞状细胞的增殖能力，降低其凋亡率，进而影响食管鳞状细胞癌组织分化程度、TNM分期[17]。

本研究对食管鳞状细胞癌患者进行了36个月的随访，结果显示miR-145高表达组生存率优于miR-145低表达组，miR-765低表达组生存率优于miR-765高表达组。以往研究证实中低分化、TNM分期Ⅲ期是食管鳞状细胞癌患者死亡的危险因素[18]，而本研究结果进一步揭示miR-145低表达、miR-765高表达是食管鳞状细胞癌患者死亡的危险因素，提示miR-145、miR-765可对患者预后判断提供帮助。

综上所述，食管鳞状细胞癌组织中存在miR-145异常低表达，miR-765异常高表达，二者与食管鳞状细胞癌组织PI、组织分化程度、TNM分期有关，食管鳞状细胞癌组织中miR-145、miR-765表达与患者生存期有关，miR-145低表达、miR-765高表达是食管鳞状细胞癌患者死亡的危险因素。